降解赤霉病菌毒素基因产物检测制造技术

本发明专利技术公开了一种降解赤霉病菌毒素基因产物检测。以兔抗GST-Tri101抗体作为一抗，羊抗兔IgG-HRP为二抗，与含有Tri101蛋白的待检测物进行Western?blot分析。本发明专利技术的Tri101基因编码单端孢霉烯3-O-乙酰转化酶，在大肠杆菌中对其进行了高效表达，将纯化的蛋白免疫新西兰白兔，得到特异性较好的抗体，并能与在BL21(DE3)中分泌表达的Tri101蛋白发生免疫印迹反应，为转入小麦和玉米中的Tri101基因提供一种新的检测方法，降低了检测成本，并为进一步研究Tri101蛋白的生物学功能奠定了坚实的基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物医药
，具体涉及一种降解赤霉病菌毒素基因产物检测。
技术介绍
赤霉病(Fusaruim head blight or scab)是危害小麦(Triticum aestivum)、 大麦(Hordeum vulgare)、燕麦(Avena sativa L·)、玉米(Zea mays L.)、7jC禾S (Oryza sativa)、黑麦(Secale cereale L.)等多种禾谷类作物的一种流行性病害，广泛分布于世界温暖潮湿地区。1884年，英国首次发现小麦赤霉病。近年来，随着全球气候的逐渐变暖以及稻-麦、玉米-麦轮作或免耕等耕作制度和方式的变化，小麦赤霉病在全世界各小麦产区呈现扩展趋势，赤霉病带来的直接经济损失也越来越严重(Bai G H, Shaner G.Scab of wheat :Prospects for control . Plant Disease,1994, 78 :760-766 ；Parry D W, Nicholson P，Mcleod LFusarium ear blight (scba) in small grain cereals-a review. Plant Pathology, 1995,44 :207-238 ；McMullen M，Jones R，Gallenberg D. FHB of wheat and barlye :Are_emerging disease of devastating impact Plant Disease, 1997,81 :1340-1348.)。我国小麦赤霉病主要发生在长江中下游诸省、直辖市以及华南冬麦区和东北春麦区东部，近年来在黄河流域及其附近区域也时有发生，逐渐向北扩展蔓延。小麦赤霉病的发生区域面积已达7 X 106hm2，约占全国小麦种植总面积的1/4，是目前我国小麦生产中最主要的病害之一(姚金保，陆维忠.中国小麦抗赤霉病育种研究进展 .江苏农业学报，2000，16 ) J42-M8 ；陆维忠，程顺和，王裕中.小麦赤霉病研究, 北京科学技术出版社，2001. 2-39.)。赤霉病的发生与流行造成了严重的产量损失。长江中下游麦区、华南麦区及东北春麦区，流行频繁，危害严重，重灾年穗发病率可达50-100%， 产量损失10-40% (李克昌.小麦赤霉病及其防治(第二版).上海上海科技出版社，1982. 1-12.)。美国和加拿大每年损失约40亿美元(Carol E W. Economic and Social Impacts of Fusarium Head Blight Changing Farms and Rurak Communities in the Northen Great Plains. Phytopathology. 2000,90 (1) :16-21 ；Perkowsky J, Kiecana I, Stachowiak J,Basinski T. Natural occurrence of scirpentriol in cereals infected by Fusarium species · Food Addit Contam. 2003,20(6) :572-8.)。如果发生赤霉病的小麦被贮藏在湿度较高的仓库内，还可造成二次侵染，造成更大的损失。小麦赤霉病由多种镰刀菌引起。在世界上不同的地区，因生态地理环境的不同， 引起赤霉病的优势致病菌种不同。1984年全国小麦赤霉病研究协作组从我国21个省市、 自治区采集小麦赤霉病穗M50份，分离鉴定出18个镰刀菌种，主要是以下5种禾谷镰刀 |if (Fusarium graminearum)(Fusarium culmorum)lif (Fusarium avenaceum)、梨孢镰刀菌(Fusarium poae)、雪腐镰刀菌(Microdochium nivale)，其中禾谷镰刀菌在各地均占优势，占94. 5% (全国小麦抗赤霉病研究协作组.小麦品种资源抗赤霉病鉴定研究.作物品种资源，1984,4:2-7.)。禾谷镰刀菌属于半知菌亚门镰孢属真菌。 其生命力强，寄主范围广，腐生性强，主要危害大麦、小麦、玉米等禾本科作物。侵染麦粒或玉米后，生出白色红色絮状或绒状菌丝，菌株生长形态性状不同，变化和变异较大。小麦赤霉病发生后，不仅造成产量损失，还因病麦粒中含有多种病菌产生的多种衍生真菌毒素及次生代谢物质而污染粮食作物种子，影响小麦的品质和商用价值，严重时引起呕吐、腹痛、头昏等急性中毒现象，该毒素可在食物链中长期存留，还可能产生致癌物质，严重威胁着人和动物的健康(Placinta C M，D，Mello JPF, Macdonald A M C. A review of worldwide contamination of cereal grains and animal feed with Fusarium mycotoxins. Anim Feed Sci Tech,1999, 78 :21-37 ；Windels C Ε.Economic and social impacts of Fusarium head blihgt Changing farms and rural communities in the Northern Great Plains . PhytoPathology, 2000,90 :17-21 ；Cleveland T E, Dowd P F, Desjardins A E, Bhatnagar D, Cotty P J. United States Department of Agricultuer—Agricultural Research Service research on pre—harvest Prevention of mycotoxins and mycotoxigenic fungi in US crops. Pest Manag Sci, 59 :629-642.)。 真菌毒素(Mycotoxin Deoxynivalenol)是一类由丝状真菌在适宜的条件下产生的有毒次级代谢产物，可在作物收获前和贮藏期间广泛污染禾谷类作物及其加工品。小麦赤霉病病麦粒中含有脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)、T_2毒素、3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇(3-Ac-D0N)、15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇(15-Ac-DON)、雪腐镰刀菌烯醇 (Nivalenol, NIV)和玉米赤霉烯酮(karalenone，ZEN)等多种对人、畜有毒的单端孢霉烯族类真菌毒素及其它类型的真菌毒素。人、畜、禽误食赤霉病麦粒或由其加工成的食品或饲料后，通常1 池内即可出现多种不同程度的中毒症状人可出现头痛、恶心、呕吐、腹泻等症状，严重时会危及生命；畜、禽常出现精神萎靡、食欲不振或拒食、腹泻等症状(徐雍皋， 陈利锋.小麦赤霉病防治理论与实践.南京江苏科学技术出版社，1993.)。为保障人民身体健康，各国政府均对商品小麦中毒素含量作出严格限制。我国政府明确规定“小麦赤霉病粒最大允许含量为4.0本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种降解赤霉病菌毒素的Ｔｒｉ１０１基因表达产物的检测方法，其特征在于，以兔抗ＧＳＴ－Ｔｒｉ１０１抗体作为一抗，羊抗兔ＩｇＧ－ＨＲＰ为二抗，与含有Ｔｒｉ１０１蛋白的待检测物进行Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ分析；所述兔抗ＧＳＴ－Ｔｒｉ１０１抗体的制备，是将纯化的ＧＳＴ－Ｔｒｉ１０１融合蛋白作为抗原，注射健康新西兰大白兔制备出兔抗ＧＳＴ－Ｔｒｉ１０１抗体，其中，（１）ＧＳＴ－Ｔｒｉ１０１融合蛋白抗血清的制备包括以下步骤：①选取１４－１６周龄的健康新西兰大白兔，每次注射１８０μｇ左右纯化的ＧＳＴ－Ｔｒｉ１０１融合蛋白抗原，在免疫前，从兔耳抽取血样，作为阴性对照；②ＧＳＴ－Ｔｒｉ１０１融合蛋白抗原５００μＬ，加５００μＬ福氏完全佐剂乳化，皮下多点注射免疫；③３周后，ＧＳＴ－Ｔｒｉ１０１融合蛋白抗原５００μＬ，加５００μＬ福氏不完全佐剂乳化，腿部肌肉多点注射免疫；④２周后，５００μＬ　ＧＳＴ－Ｔｒｉ１０１融合蛋白抗原免疫；⑤１周后，再次用１ｍＬ　ＧＳＴ－Ｔｒｉ１０１融合蛋白抗原加强免疫，同时，从兔耳抽血样，采用间接ＥＬＩＳＡ进行多抗血清效价测定；⑥１周后，杀兔收集血液，收集的血液置室温下凝固；⑦将凝固的血液放入３７℃温箱内半小时，再置４℃冰箱过夜，使血块收缩，抗血清析出；⑧吸出抗血清，３０００ｒｐｍ离心１０ｍｉｎ，吸上清液分装，－７０℃保存备用；（２）ＧＳＴ－Ｔｒｉ１０１融合蛋白抗血清的纯化包括以下步骤：①用ｐＨ值为７．４的ＰＢＳ溶液将血清稀释２倍；②搅拌下逐滴加入饱和硫酸铵溶液，其ｐＨ值为７．４，使其饱和度达到５０％，４℃静置２小时以上；③在４℃条件下，以１２０００ｒｐｍ离心２０ｍｉｎ，将其沉淀溶于２倍的ＰＢＳ溶液中；④加入饱和硫酸铵溶液，其ｐＨ值为７．４至溶液饱和度达到３３％，４℃静置２小时以上；⑤在４℃条件下，以１２０００ｒｐｍ离心２０ｍｉｎ，沉淀用少量的ＰＢＳ溶液溶解；⑥在４℃条件下，在大于２０倍体积的ＰＢＳ溶液中透析２４小时，中间更换透析液３次；⑦收集透析液，－２０℃保存备用。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：薛保国，杨丽荣，雷振生，全鑫，孙虎，宋玉立，闫海霞，鲁传涛，郭松景，赵献林，刘红彦，吴坤，何文兰，吴政卿，王恒亮，曹岳恩，武超，王亚南，马雪皎，王爱平，刘明源，
申请(专利权)人：河南省农业科学院，
类型：发明
国别省市：41