本发明专利技术涉及分子生物学和微生物学领域，公开了一种荧光筛选载体及其构建与应用，本发明专利技术的荧光筛选载体，以编码增强型绿色荧光蛋白的多核苷酸和/或其互补链为其阳性克隆筛选标记，所述增强型绿色荧光蛋白的氨基酸序列为SEQID?NO.5。本发明专利技术的载体能够广泛应用于基因克隆中阳性克隆的筛选。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学和微生物学领域。具体的讲，本专利技术涉及一种荧光筛选载体，同时涉及到该载体的构建方法，以及该载体在精确筛选细菌阳性菌落中的应用。
技术介绍
70年代后，以基因工程技术的出现作为新的里程碑，标志着人类深入认识生命本质并能改造生命的新时期开始，其间的重大成就包括重组DNA技术的建立和发展。重组 DNA (Recombinant DNA)技术是遗传工程的核心技术，也是人类在基因和DNA分子水平进行操作的技术。它包括以下几个步骤1)重组DNA分子的构建；2)将重组DNA分子转化宿主细胞；3)重组子筛选及增殖；4)收获扩增后的培养细胞，提取重组DNA分子(质粒)，并纯化，获得某一基因或DNA片段的大量拷贝。蓝白斑筛选是重组子筛选的一种方法，是根据载体的遗传特征筛选重组子，如 α -互补、抗生素基因等。现在使用的许多载体都带有一个大肠杆菌的DNA的短区段，其中有半乳糖苷酶基因(IacZ)的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点(MCS)，它并不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能，这种载体适用于可编码β -半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞。因此，宿主和质粒编码的片段虽都没有酶活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。这样，IacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，称为α-互补。由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂 IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。然而，当外源DNA 插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致无α-互补能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选，又称为蓝白斑筛选。如用蓝白斑筛选则经连接产物转化的钙化菌平板37°C温箱倒置培养12-16hr后，有重组质粒的细菌形成白色菌落。蓝白斑筛选重组子的方法一直沿用至今，基本可以满足实验需要。但是我们在长期大量实验中总结发现，有些时候平板生长15小时以上，仍然无法分辨出蓝白斑，或者全部为蓝斑；总结如下1)某些特定的基因会影响细菌正常成长，致使细菌生长缓慢，菌落在常规时间内无法生长到一定大小，以至于肉眼无法分辨其颜色；2)插入基因片段太小并没有破坏编码框，以至于表达的蛋白仍然可以产生α-互补效应；幻基因工程菌株并没有对应的IacZ基因缺陷。绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Portein，GFP)是从一种生活在北太平洋寒冷水域的水母体内发现的，它的27k Da的单体由238个氨基酸构成，本身就是一个生物发光系统，附带有激发后能发射生物荧光的发光色基，其发光过程不同于其它生物发光组织，不需荧光素酶参与，也不需要任何的协同因子、底物等。当GFP在原核或真核细胞中表达并受到蓝光或紫外光辐照时就可发出亮绿色荧光。GFP荧光极其稳定，在激发光照射下，GFP抗光漂白(Photobleaching)能力比荧光素(fluorescein)强，特别在450 490nm蓝光波长下更稳定。GFP需要在氧化状态下产生荧光，强还原剂能使GFP转变为非荧光形式，但一旦重新暴露在空气或氧气中，GFP荧光便立即得到恢复.而一些弱还原剂并不影响GFP荧光.中度氧化剂对GFP荧光影响也不大， 如生物材料的固定，脱水剂戊二酸或甲醛等。GFP融合蛋白的荧光灵敏度远比荧光素标记的荧光抗体高，抗光漂白能力强，因此更适用于定量测定与分析.GFP的晶体结构是由11个β -折叠组成的柱状结构，直径约3nm，长约4nm。柱中央有一个α-螺旋(图1)，发色基团在α-螺旋上，非常靠近柱的中心(图1，图2)。蛋白的二级结构大部分为α-螺旋和β-折叠。GFP色基是由丝氨酸酪氨酸甘氨酸GerTyrGly)形成的环化三肽所构成，并且只有色基包被在完整的GFP蛋白中才能发出荧光，被切断的GFP(即使是C末端的少数几个氨基酸)亦能导致GFP失去发光能力。GFP和GFP S65T的晶体结构研究表明色基紧密地包被在由β折叠围成的β盒中。这一结构提供了色基发射荧光的微环境，该环境排除了基质及氧对色基发光的影响。这种保护对于发射荧光是必需的。一但发色团吸收一个光子，激活的水分子通常就会夺取它的能量。但是在蛋白质内部改为发射能量稍低的光子来释放能量，使它得到了保护。发色团由蛋白质链上的三个氨基酸甘氨酸，酪氨酸和苏氨酸(或丝氨酸)自发形成。只具备一级结构GFP是不能发光的，功能性色基的形成是在转录翻译后， 并经历一个环化反应和一分子氧的氧化步骤。RedSiifted(红偏移)GFP突变系(EGFP & GFP S65T)色基发生了氨基酸取代， Xmax(Excitation)偏移至490nm附近。红偏移突变系的最大激发峰都落在常用滤色片的波长范围内，所以获得的荧光信号要比wtGFP明亮得多。同样，FACS和共焦显微镜的氩离子光源的发射波长为488nm，对RedShifted突变系的激发效率也明显高于wtGFP。EGFP发生了双氨基酸取代，Leu (亮氨酸)取代Phe64 (苯丙氨酸)，Thr (苏氨酸)取代Ser65 (丝氨酸)。基于等量溶解蛋白的光谱分析，由于Em(消光系数)的增加和色基构型的高效率， EGFP在488nm处激发后灯荧光强度为wtGFP的35倍。在相同条件下089歷)测得EGFP 得 Em 为 53，OOOcm-IM-I，而 wtGFP 为 9，500CM-1M-1，GFPS65T 为 55，OOOcm-IM-I0 EGFP 的色基构型在37°C比wtGFP或GFPS65T发光效率更高，在这一温度下表达的EGFP可溶性蛋白95%为有效色基。GFPS65T为Thr取代Ser65的突变体，同样条件下，它的荧光强度强于 wtGFP4 6倍，并且其唯一的Redshifted激发峰位于490nm，但37°C时色基形成的效率不如 EGFP。
技术实现思路
本专利技术的目的是在于克服现有技术中的缺陷，提供一种荧光筛选克隆载体及其制备与应用。本专利技术的载体替换了原有载体的IacZ的α -互补筛选，而采用绿色荧光蛋白作为筛选标准。绿色荧光蛋白基因在Lac启动子启动下完成表达，只要有该功能蛋白的产生，即能够准确快速的检测到阳性克隆的存在。本专利技术一方面提供了一种荧光筛选克隆载体，以编码增强型绿色荧光蛋白的多核苷酸和/或其互补链为其阳性克隆筛选标记，所述增强型绿色荧光蛋白的氨基酸序列为 SEQ ID NO. 5。较佳的，所述编码增强型绿色荧光蛋白的多核苷酸序列为SEQ ID NO. 4。较佳的，所述荧光筛选克隆载体的多核苷酸序列为SEQ ID NO. 1。其结构图如图 11。本专利技术第二方面提供了所述荧光筛选克隆载体的制备方法，为将编码增强型绿色荧光蛋白的多核苷酸和/或其互补链克隆入载体，所述绿色荧光蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO. 5。进一步的，所述编码绿色荧光蛋白的多核苷酸的核苷酸序列为SEQ ID NO. 4。所述编码绿色荧光蛋白的多核苷酸可采用化学合成的方式获得，如设计引物并用 overlap PCR方法拼接获得。如实施例列举的，克隆入的载体可为pUC18。所述荧光筛选克隆载体可为将编码增强型绿色荧本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种荧光筛选克隆载体，以编码增强型绿色荧光蛋白的多核苷酸和／或其互补链为其阳性克隆筛选标记，所述增强型绿色荧光蛋白的氨基酸序列为ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：孔凡静，王素莲，王绪慧，
申请(专利权)人：生工生物工程上海有限公司，
类型：发明
国别省市：31
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