一种恢复豆梨玻璃化试管苗的方法技术

本发明专利技术涉及一种恢复豆梨玻璃化试管苗的方法，属于生化工程技术。将豆梨玻璃化苗放入灭菌的三角瓶空瓶中，加盖无菌封口透气膜，放置72小时，使试管苗组织含水量达50-70%；再放入转接入无细胞分裂素的培养基上，在温度为25℃，12h/d光照，光强2000-5000lux的条件下，培养30天。可以有效恢复玻璃化苗，轻度玻璃化苗恢复率在90%以上，重度玻璃化苗恢复率30%以上。是一种简单、易行，又可以高效恢复玻璃化苗为正常苗的技术措施。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生化工程技术中植物培养的方法，特别涉及一种恢复豆梨玻璃化试管 苗的方法。
技术介绍
试管苗玻璃化(hyperhydricity)是指组织培养过程中的特有的一种生理失调或 生理病变，试管苗呈半透明状外观形态异常的现象。玻璃化苗的叶和嫩梢呈水晶透明或半 透明水渍状；整株矮化肿胀、失绿；叶片皱缩成纵向卷曲，脆弱易碎；叶表缺少角质层蜡质， 没有功能性气孔，不具栅栏组织，仅有海绵组织。玻璃化苗中因其体内含水量高，干物质、叶 绿素、蛋白质、纤维素和酶活性降低，组织畸形，器官功能不全，分化能力降低，所以很难成 活，严重影响组培苗繁殖率的提高。玻璃化现象的产生与很多因素有关，如植物组织畸形、 木质素含量过低，植物体内会发生乙烯过饱和、细胞通透性降低或气孔关闭等，从而导致细 胞内多余水分不能及时排出，发生玻璃化现象。根据玻璃化程度又分为轻度玻璃化和重度玻璃化。轻度玻璃化苗茎半透明水浸 状，叶片狭长，边缘卷曲半透明，茎叶均脆弱易碎。重度玻璃化苗植株矮小，茎透明肿胀，无 明显茎节，叶片肥厚、扭曲、透明，茎叶均脆弱易碎。玻璃化苗绝大多数为来自茎尖或茎段培养物的不定芽。通常玻璃化苗恢复正常的 比例很低，在继代培养中仍然形成玻璃花苗，因此，玻璃化苗是试管苗生产中亟待解决的问 题。玻璃化现象的产生与很多因素有关，如植物组织畸形、木质素含量过低，植物体内会发 生乙烯过饱和、细胞通透性降低或气孔关闭等，从而导致细胞内多余水分不能及时排出，发 生玻璃化现象。玻璃化苗含水量高于正常苗，因此，玻璃化发生与植物体内含水量过高有关。植物 排除体内多余水分方式之一就是靠蒸腾作用。在玻璃化的植物苗中只有一个保卫细胞，而 且畸形，形状狭窄，气孔关闭，所以蒸腾作用减少，引进体内水分积累，细胞体积膨胀，液泡 程度加剧，细胞质变薄，这一系列变化造成对细胞的挤压，促使气孔进一步关闭。通常玻璃化苗恢复正常的比例很低，在继代培养中仍然形成玻璃花苗，因此，玻璃 化苗是试管苗生产中亟待解决的问题。目前，已经有80多种植物有玻璃化现象报道，但试 管苗玻璃化后，恢复措施研究相对较少。现有研究认为，培养温度由恒温改为变温、降低培 养基中6-BA浓度、增加卡拉胶含量可以使仅部分叶片出现玻璃化的红叶石楠组培苗转为 正常苗。蓝莓玻璃化苗恢复研究中也认为，玻璃化试管苗在调整培养温度及玉米素浓度的 条件下，可以不同程度的恢复。番木瓜恢复措施研究方面，则认为利用番木瓜营养液培养其 玻璃化组培苗能有效地控制玻璃化苗的发生，使其逆向转化。
技术实现思路
技术问题本专利技术的目的在于提供一种简单、易行，又可以高效恢复玻璃化苗为正常苗的技术措施。技术方案，步骤如下(1)配制培养基在MS培养基中添加30g/L的蔗糖，6g/L的琼脂，pH值调至 5. 6-6. 0,并进行高压灭菌处理；(2)玻璃化试管苗脱水处理将玻璃化苗放入灭菌的三角瓶空瓶中，加盖无菌封 口透气膜，放置72小时，使试管苗组织含水量达50-70%。(3)玻璃化苗恢复培养将经脱水处理的试管苗取出，放入上述培养基中培养，在 温度为25°C，12h/d光照，光强2000-50001UX的条件下，培养30天。试管苗脱水处理所用的三角瓶和封口膜均经高温灭菌处理。条件为温度25°C， 12h/d 光照，光强为 2000-50001ux。有益效果豆梨生长过程中含水量急剧增加，玻璃化苗超度含水，组织含水量较正常苗高 50%以上。本专利技术在对玻璃化苗适度脱水处理后，转接入无细胞分裂素的培养基上，进行培 养，可以有效恢复玻璃化苗，轻度玻璃化苗恢复率在90%以上，重度玻璃化苗恢复率30% 以上。是一种简单、易行，又可以高效恢复玻璃化苗为正常苗的技术措施。附图说明图1所示为正常苗、轻度玻璃化苗、重度玻璃化苗、恢复苗植株形态。图2所示为正常苗、轻度玻璃化苗、重度玻璃化苗、恢复苗叶片扫描电镜观察结^ οa.正常苗叶片气孔分布；b.轻度玻璃化苗叶片气孔分布；c重度玻璃化苗叶片气 孔分布；d.正常苗叶片单个气孔；e.轻度玻璃化苗单个畸形气孔；f.重度玻璃化苗单个畸 形气孔；g.恢复苗叶片气孔分布；h.恢复苗单个气孔图3所示为正常苗、轻度玻璃化苗、重度玻璃化苗、恢复苗叶绿体结构透射电镜观 察效果。备注a.正常苗椭圆形叶肉细胞；b.正常苗叶绿体细胞；C.正常叶绿体类囊体细 胞；d.轻度玻璃化苗的叶肉细胞；e.轻度玻璃化苗的叶绿体细胞；f.轻度玻璃苗化叶绿体 的类囊体细胞；g.重度玻璃化苗叶肉细胞；h.重度玻璃化苗叶绿体细胞；i.重度玻璃化苗 叶绿体类囊体细胞；j.恢复苗叶肉细胞；k.恢复苗叶绿体细胞；1.恢复苗叶绿体类囊体细 胞实施例1 不同脱水处理对玻璃化苗恢复的影响，本例以轻度玻璃化苗的恢复为 例，设9种脱水处理，比较不同处理对玻璃化苗修复的差异。(1)配制培养基在MS培养基中添加30g/L的蔗糖，6g/L的琼脂，pH值调至 5. 6-6. 0,并进行高压灭菌处理；(2)玻璃化试管苗脱水处理具体处理如下处理1 将玻璃化苗放入灭菌的三角瓶空瓶中，加盖无菌封口透气膜，放置72h，温 度 25°C，12h/d 光照，光强为 2000-50001ux。处理2 将玻璃化苗放入灭菌的三角瓶空瓶中，加盖无菌封口透气膜，放置48h，温 度 25°C，12h/d 光照，光强为 2000-50001ux。处理3 将玻璃化苗放入灭菌的三角瓶空瓶中，加盖无菌封口透气膜，放置Mh，温 度 25°C，12h/d 光照，光强为 2000-50001ux。处理4 将玻璃化苗放入灭菌的三角瓶空瓶中，摆放于超净工作台，开口吹30min， 风速 0. 3m/s。处理5 将玻璃化苗放入灭菌的三角瓶空瓶中，摆放于超净工作台，开口吹20min， 风速 0. 3m/s。处理6 将玻璃化苗放入灭菌的三角瓶空瓶中，摆放于超净工作台，开口吹lOmin， 风速 0. 3m/s。处理7 玻璃化苗植入培养基，摆放于超净工作台，开口吹90min，风速0. 3m/s。处理8 玻璃化苗植入培养基，摆放于超净工作台，开口吹60min，风速0. 3m/s。处理9 玻璃化苗植入培养基，摆放于超净工作台，开口吹30min，风速0. 3m/s。(3)玻璃化苗恢复培养将上述处理1-6的脱水苗取出，放入培养基中封口培养。培养温度为25°C，Uh/d 光照，光强2000-50001uX的条件下，培养30天。处理7-9脱水处理后脱水苗在原培养基中封口培养，培养温度为25°C，iai/d光 照，光强2000-50001uX的条件下，培养30天。对照设置轻度玻璃化苗未经脱水处理后直接转入培养基封口后，在温度为 25°C，12h/d光照，光强2000-50001uX的条件下，培养30天。处理结果如表1所示9个处理中，处理1玻璃化苗恢复率最高。另外，比较了处 理1条件下重度玻璃化苗和轻度玻璃化苗的修复效果(表幻，处理1对重度玻璃化苗的恢 复率达到32. 1% O表1轻度玻璃化苗脱水处理结果权利要求1.，步骤如下(1)配制培养基在MS培养基中添加30g/L的蔗糖，6g/L的琼脂，PH值调至5.6-6. 0， 并进行高压灭菌处理；(2)玻璃化试管苗脱水处理将豆梨玻璃化苗放入灭菌的三角瓶空瓶中，加盖无菌封口 透气膜，放置72小时，使试管苗组本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种恢复豆梨玻璃化试管苗的方法，步骤如下：（１）配制培养基：在ＭＳ培养基中添加３０ｇ／Ｌ的蔗糖，６ｇ／Ｌ的琼脂，ｐＨ值调至５．６－６．０，并进行高压灭菌处理；（２）玻璃化试管苗脱水处理：将豆梨玻璃化苗放入灭菌的三角瓶空瓶中，加盖无菌封口透气膜，放置７２小时，使试管苗组织含水量达５０－７０％；（３）玻璃化苗恢复培养：将经脱水处理的试管苗取出，放入上述培养基中培养，在温度为３０℃，１２ｈ／ｄ光照，光强２０００－５０００ｌｕｘ的条件下，培养３０天。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王中华，蔺经，李晓刚，王宏伟，杨青松，盛宝龙，常有宏，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：84