一种亲和筛选菠萝蛋白酶的亲和配基的方法技术

本发明专利技术涉及一种亲和筛选菠萝蛋白酶的亲和配基的方法，包括：(1)生物淘洗；(2)噬菌体定向扩增与富集：(3)滴度测试；(4)单克隆噬菌体扩增；(5)ELISA测试；(6)DNA测序，Ile-XXX-Ser-Pro-XXX-XXX-XXX(LXSPXXX)。本发明专利技术的制备方法简单，成本低廉，大肠杆菌与噬菌体的生物资源丰富；选出来的对菠萝蛋白酶有亲和作用的7肽配基对菠萝蛋白酶有较高的亲和作用，并且能够发现其一致序列，对于蛋白质组学中的蛋白质互相作用提供丰富的实验数据；菠萝蛋白酶高亲和力的7肽配基更可用于对菠萝蛋白的分离纯化研究。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
１．一种亲和筛选菠萝蛋白酶的亲和配基的方法，包括：（１）酶标板包被１００～３００μｌ菠萝蛋白酶溶液，４℃轻微震荡，孵育１２－２４ｈ，之后冲洗包被液，加满封阻液，０～４℃静置１～２ｈ，完成后去除封阻液，用ＴＢＳＴ缓冲液迅速洗酶标板２～１０次；噬菌体７肽库以５～１０倍稀释度加入上述酶标板的酶标孔中，摇动１～２ｈ，ＴＢＳＴ缓冲液迅速洗酶标板２～１０次，用５０～１００μｇ／ｍｌ游离菠萝蛋白酶分子ＴＢＳ洗脱液竞争性洗脱吸附在固相酶标板上的噬菌体，室温摇动１～２ｈ，洗脱下来的噬菌体作滴度测试；（２）挑取ＥＲ２７３８菌株培养于ＬＢ－Ｔｅｔ培养液中，２５～３７℃１８０～２００ｒｐｍ振荡培养１２－２４ｈ，之后用不加抗生素Ｔｅｔ的ＬＢ培养液１∶５０～１∶１００稀释并再次培养待用，步骤（１）噬菌体洗脱液定量加入至上述大肠杆菌菌液中，２５～３７℃，６０～１００ｒｐｍ感染１～２ｈ，０～４℃，离心１０～２０ｍｉｎ，去上清，菌体重悬至１００～２００ｍｌ　ＬＢ培养液中培养８～１４ｈ，取培养后的菌液０～４℃，离心１０～２０ｍｉｎ，取上清，加入体积比为１∶３～１∶６的聚乙二醇和氯化钠，震荡混匀后冰置１～２ｈ，在０～４℃，８０００～１５０００ｒｐｍ离心１０～２０ｍｉｎ去上清，沉淀物重悬于１～２ｍｌ　ＴＢＳ溶液，再加体积比为１∶３～１∶６的聚乙二醇和氯化钠溶液进行再沉淀，冰置１～２ｈ后，０～４℃，８０００～１２０００ｒｐｍ离心１０～２０ｍｉｎ，弃上清，再快速离心移去残余上清液，沉淀重悬于１００～２００μｌ　ＴＢＳ，０．０１～０．０２％ＮａＮ３中，得扩增后的噬菌液；（３）将上述扩增后的噬菌液分别用ＴＢＳ缓冲液稀释１０～１０３倍，噬菌液加入到大肠杆菌菌液，快速震荡混匀，室温温育２～５ｍｉｎ，然后将感染的菌液注入４０～５０℃的顶层琼脂试管中，快速震荡混匀并立即倾注于２５～３７℃预温的ＬＢ／ＩＰＴＧ／Ｘｇａｌ平板上，均匀铺开，２５～３７℃倒置培养１２－２４ｈ，之后计数平板；（４）挑取上述ＬＢ－ＩＰＴＧ／Ｘｇａｌ平板上蓝色噬菌斑１０～２０个分别装入上述１～２ｍｌ　ＥＲ２７３８菌液中，２５～３７℃１８０～２２０ｒｐｍ震荡培养４～５ｈ，离心后取上清液即得单克隆扩增液；（５）１００～３００μｌ　ｐＨ　８．６菠萝蛋白酶０～４℃包被１２－２４ｈ，吸出包被液，加满封阻液，２５～３７℃静置１～２ｈ，完成后吸出封闭液，用ＴＢＳＴ快速洗板２～１０次，每孔加入１００～３００μｌＴＢＳＴ，每排第二孔加入１０～２０μｌ的单克隆扩增液，并稀释至１２孔，２５～３７℃缓慢震荡１～２ｈ，甩出单克隆扩增液，ＴＢＳＴ洗涤６～１０次后，每孔加入１００～３００ｕｌ抗ｆｄ噬菌体生物素复合物，轻轻混匀２０～３０ｓｅｃ，封板后２５～３７℃温育１～２ｈ，ＴＢＳＴ再次洗涤６～１０次，每孔加入１００～３００ｕｌ抗生物素辣根过氧化物酶复合物，轻轻混匀２０～３０ｓｅｃ，封板，２５～３７℃同样温育１～２ｈ，ＴＢＳＴ再次洗板６～１０次，每孔加入１００～３００ｕｌ邻苯二胺显色液，轻轻混匀５～１０ｓｅｃ，２５～３７℃暗处显色０．２～１ｈ，显色后每孔加入１００～３００μｌ　１～２ＭＨ２ＳＯ４终止液，轻轻混匀２０～３０ｓｅｃ；２０～３０ｍｉｎ内测ＯＤ值；（６）挑取步骤（５）中的ＥＬＩＳＡ阳性单克隆噬菌体以－９６引物进行测序，解读７肽氨基酸排列序列。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：朱利民，陈天翔，聂华丽，汪雯，
申请(专利权)人：东华大学，
类型：发明
国别省市：31