本发明专利技术属于一种桉树遗传转化与再生方法，特别是关于利用尾叶桉无菌苗下胚轴为外植体进行遗传转化和再生的方法。以尾叶桉幼苗下胚轴为外植体经预培养诱导愈伤组织，与携带外源基因的农杆菌共培养转化，用卡那素进行选择，经不定芽诱导、芽增殖、不定芽伸长、生根及移栽，得到拟转化植株。本方法获得的尾叶桉拟转化植株，经PCR和RT-PCR检测表明，外源基因导入了尾叶桉基因组中，并得到表达；在转萝卜抗真菌蛋白(RS-AFP2)基因的尾叶桉离体叶片的抗病性检测中发现，转化植株对疫霉菌具有较好的抗性；抗性相关酶活测定结果显示，转化植株在接种后，苯丙氨酸解氨酶(PAL)、过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)活性增强。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于桉树遗传转化与再生方法，特别是关于尾叶桉的遗传转化与再生。
技术介绍
桉树(Eucalyptus)属桃金娘科(Mytacea)，桉属(Eucalyptus)，原产于澳大利， 现有1000多个种及亚种。桉树具有许多显著的特点①材质坚硬，材、皮、叶、花的经济价值都很高，既是用材林、经济林、防护林、风景林，又是很好的能源树种；②繁殖容易，速生丰产，特别是幼林期生长快，大大缩短了生产周期，能获得更高的经济效益；③种类多，抗逆性强，既有耐热树种，也有耐寒树种，病虫害少，较耐瘦瘠，可在不同气候带栽植。桉树的木材是造纸、造船的良材，叶子可提油料，树皮可提树脂，残渣培养食用菌后还可当肥料，花是良好的蜜源。正因桉树有上述用途，加之生态适应性广、速生、抗逆性强、用途广泛等优点，已被世界热带、亚热带地区广泛引种栽培。目前全世界有100多个国家种植桉树，种植面积超过2000万公顷，桉树已经成为短周期原料林的主要树种。我国最早引种是1890年，零星引种在城市公园，铁路边等四旁绿化场地。真正大规模系统地开展引种和推广栽培始于20世纪50年代的雷州半岛。80年代初，澳大利亚援助中国在广西东门林场开展桉树系统引种和育种实验，引进了 174个桉树品系和种源，建立了树木园和桉树良种基因库。现在，桉树已经成为我国南方地区发展速生丰产林的战略树种。目前桉树广泛栽种于我国从东海之滨到云贵高原的广大地区。据不完全统计，我国现有桉树人工林总面积达到200万公顷，并正以每年10万公顷的速度增长。桉树生长周期长，而且遗传性高度杂合，应用常规的育种方法育种周期长，利用基因工程手段可打破种间杂交不亲和的界限。利用基因工程进得桉树转基因育种的前提是建立桉树组织培养再生系统与遗传转化的受体系统。从20世纪60年代以来，植物细胞的全能性，在理论上和实践上都得到了充分的论证，植物组织培养进入了迅速发展时期，桉树某些品种的组织培养也于20世纪60年代逐渐开始。迄今为止，已有60多种桉树的组织培养获得成功，绝大部分是国外首先取得成功。Hatney用简单的培养基在普通家用冰箱中保存钝盖赤桉(E. camaldulensis)和巨桉(E. grandis)裸芽培养物达8个月之久；Bachelard和 Stowe用一种含14%椰子汁的液体培养基保存实生苗的根系，根冠部分可以接种在同种培养基上，但没有芽的再生；Sussex由赤桉(E. camaldulenses)实生苗外植体获得了愈伤组织；Aneja等由柠檬桉(E. citriodora)木质块茎的愈伤组织诱导出小植株；Kitahara等人从白桉(E.alba)的下胚轴培养产生愈伤组织并分化形成了小植株；De R)SSard等人从榕叶桉(E.ficifolia)的茎节离体培养，能繁育大量苗木；LakshmiSita发现，从柠檬桉子叶愈伤组织诱导再生芽的条件为0. 2mg/L IAA和lmg/L ZT以及光周期12小时的荧光灯光照，这些芽能在只含有生长素的培养基上形成根；P. K. Gupta等人用组织培养法无性繁殖柠檬桉，并于1981年用成年柠檬桉树嫩枝茎段诱导出了完整植株；S. Kondas将一棵20年生的桉树成功培养出芽；Adam将冈尼桉(E. gunnii)的离体根培养在不含激素的MS固体培养基上，但没有分化成芽；Qin和Kirby用葡萄桉(E. botryoides)、邓恩桉(E. dunnii)、巨桉(E. grandis)和野桉(E. rudis)幼苗的子叶、下胚轴以及成年巨桉(E. grandis)优良无性系的幼叶为材料诱导出类似胚状体的结构。此后更有不少相关报道，E. tereticornis, E. grandis、E. Urophylla.E. Globulus,Ε. grandisXΕ. uropHylla 等树种已能经器官发生途径再生。E. Citriodora, E. Grandis和E. dunnii等树种已能经体细胞胚胎发生途径再生。20世纪80年代初欧阳权首次对桉树胚状体的发生进行了研究，此后，桉树组织培养的研究工作全面展开，首先在雷林1号桉(E. Ieichow No. 1)、巨尾桉(E. grandis XE. urophylla)等树种首先取得成功。谢丽萍等用四个产地柳窿桉(E. salignaXexserta)优良无性系的基部萌条嫩茎为外植体进行了组织培养研究，并获得了再生植株。韩美丽等以雷林一号桉及尾叶桉为材料建立了原生质体分离体系；同年，又报道了以尾叶桉、柳窿桉的胚性愈伤组织为亲本材料，采用PEG (聚乙二醇)融合法研究了影响原生质体融合的主要影响因素。2003年，蔡燕灵等用二次回归旋转设计对桉树DH33^和E3两个无性系进行组培试验，研究了其继代培养芽的叶片增大与培养基中细胞分裂素6-BA和生长素NAA浓度的关系。石大兴等研究了以巨桉(Eucalyptusgrandis)幼树带芽茎段为外植体诱导丛生芽发生以及植株再生的过程，对培养过程中新芽及丛生芽的发生类型进行了探讨，通过正交实验及单因素试验，确定了巨桉快繁体系的最适培养条件。随后，卜朝阳通过试验，获得了桉树四种再生系统。关亚丽等以无菌苗叶片为外植体进行了赤桉不定芽的诱导及植株再生。易敏等以邓恩桉无菌苗的下胚轴和半木质化的带芽茎段为外植体，诱导芽的分化及丛生芽产生，对培养基中不同生长素和细胞分裂素的浓度和配比进行了讨论，确定了邓恩桉组织培养最适培养条件。邱璐等研究了史密斯桉愈伤组织的诱导及分化，并取得了一定的结果。王以红等将邓恩桉种子在无菌环境下萌动，切割其下胚轴进行离体培养，建立不定芽发生和植株再生的微繁殖体系。刘奕清等以尾细桉Ml的单芽茎段为外殖体进行离体培养和快速繁殖研究，建立了尾细桉Ml离体再生体系。邱璐等对史密斯桉愈伤组织的诱导及分化进行了较为深入的研究，优化了史密斯桉愈伤组织诱导及分化系统为其无性繁殖和转基因研究奠定了基础。Teulieres等人第一次在R尼桉原生质体上比较了 PEG法和电泳冲法控制下转化报告基因的差异以来，科研人员先后进行了柠檬桉(E. citriodora)、蓝桉 (E. globules)、赤按(E. camaldulensis)、巨按(E. grapdis)、小套按(E. microtheca)、黄皮桉(E. ochropHloia)及边缘桉(E. marginata)等的遗传转化的初步研究。现已获得转基因桉树的有蓝桉、赤桉和巨桉。Harcourt用农杆菌介导将抗除草剂和抗虫基因转入桉树，获得了多重抗性的转化植株。张景宁报道，柞蚕抗菌肽对桉树青枯假单胞菌有杀灭作用。邵志芳等用柞蚕抗菌肽D基因转化桉树发现转化苗对青枯病的抗性有较大提高。Virginie研究了与桉树木质素合成紧密相关的乙醇脱氢酶的启动子。Bloksberg 等人从辐射松(Pinusradiata)中分离出了木质素合成途径中的酶0_甲基转移酶和 cinnamoy-CoAreductase基因，通过农杆菌转入到桉树的植物中。2007年赖家业等人在建立的尾巨桉(E. urophyllaXE. grandis) 3226,3228无性系高频再生体系的基础上，利用GUS染色组织分析法探讨了各因素对尾巨桉茎段本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种尾叶桉遗传转化与再生的方法，其特征在于：采用尾叶桉无性系种子萌发实生苗的下胚轴为外植体进行遗传转化与再生；愈伤组织诱导后与携带外源基因的农杆菌共培养，经不定芽诱导培养、芽增殖培养、不定芽伸长培养、选择性生根培养及移栽，得到拟转化植株。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：曾富华，
申请(专利权)人：湛江师范学院，
类型：发明
国别省市：44
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