GFP泄露试验方法技术

本发明专利技术公开了一种GFP泄露试验方法，属于毒理学检测技术领域。该方法采用转基因技术获得表达GFP(绿色荧光蛋白质)的动物细胞，然后制备细胞悬液和裂解液，分别与受试物孵育后检测GFP的荧光值，计算细胞GFP泄漏率和变性率。通过分析细胞GFP泄漏率和变性率与受试物MMAS值的关系，建立了一种通过GFP泄漏率和变性率判断受试物眼刺激性的替代试验方法。本发明专利技术所建立的检测方法成本低，操作简便快速、适用受试物谱广、预测准确性高、稳定性好，是一种有前途的眼刺激性替代试验方法。利用腺病毒载体转导目的基因具有高效率、低致病性、高滴度、以及在体内不整合入宿主细胞染色体等优点。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
１．一种ＧＦＰ泄露试验方法，其特征在于，包括下列步骤：Ａ．含有表达载体Ｐｓｈｕｔｔｌｅ－ＣＭＶ－ＧＦＰ的腺病毒包装细胞的选择：２９３细胞培养于１０％胎牛血清的ＲＰＭＩ１６４０培养基，ＳＩＲＣ细胞贴壁培养于１０％胎牛血清的高糖ＤＭＥＭ培养基，培养条件为３７℃，５％ＣＯ２；将含有Ｐｓｈｕｔｔｌｅ－ＣＭＶ－ＧＦＰ目的基因的载体病毒转染２９３细胞中；Ｂ．腺病毒制备和滴度测定：取５０ｍｌ　２９３细胞，７０％铺满，常规细胞培养，使细胞数达到１０５／ｍＬ，用９６孔酶标板铺板，每孔加入１００μＬ细胞悬液，共铺１０排；准备１０个１．５ｍＬＥＰ管，每管加９００μＬ的无血清ＲＰＭＩ　１６４０培养基，第一管加１００μＬ病毒液，混匀；取１００μＬ第一管的病毒液加入到第二管，按梯度稀释法稀释直到第九管；在上述９６孔酶标板的每行加入一个稀释度的病毒液１００μｌ，第１０排加无血清的培养基作为阴性对照；３７℃、ＣＯ２温箱孵化７－１０天，观察细胞出现ＣＰＥ的情况；记数每排出现ＣＰＥ的孔数，计算细胞病变率：Ｔ＝１０１＋ｄ（Ｓ－０．５）／ｍＬ；ｄ＝Ｌｏｇ　１０稀释度；Ｓ＝各浓度中ＣＰＥ细胞病变比率之和；根据ＫＡＲＢＥＲ公式计算出用于细胞感染的病毒滴度为１０７ＴＣＩＤ５０／ｍＬ；Ｃ．ＧＦＰ阳性细胞悬液和细胞裂解液的制备：取８０％汇合度的细胞，用已确定滴度的Ｐｓｈｕｔｔｌｅ－ＣＭＶ－ＧＦＰ病毒液感染，２４ｈ后用荧光显微镜观察细胞发光情况；当细胞ＧＦＰ阳性率达到８０％以上时，收集细胞，制备成５×１０５／ｍＬ细胞悬液；细胞悬液经反复冻融，制成细胞裂解液；Ｄ．受试物处理和荧光检测：将受试物用含１％牛血清白蛋白的０．１ｍｏｌ／Ｌ的ＰＢＳ配成浓度为１０％、１％和０．１％的溶液、悬液或悬浊液，向容积为５００μＬ的ＥＰ管中加入２００μＬ细胞悬液或细胞裂解液和２００μＬ受试物；对照组以含１％牛血清白蛋白的０．１ｍｏｌ／Ｌ的ＰＢＳ替代受试物以计算自溶发光值；每处理组重复样本数为３；在３７℃摇床中孵育１０ｍｉｎ，加入细胞悬液的处理组以２０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，取上清液２００μＬ加入９６孔酶标板；加入细胞裂解液的处理组直接取２００μＬ加入９６孔酶标板，在酶标仪上以４８５ｎｍ和５３５ｎｍ测其发光度值；Ｅ．ＧＦＰ漏出率、ＧＦＰ变性率计算：ＧＦＰ泄漏率＝［（受试物上清液发光度值－对照上清液发光度值）／对照发光度值］×１００％；ＧＦＰ变性率＝［（对照裂解液发光度值－受试物裂解液发光度值）／对照裂解液发光度值］×１００％。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：帅培强，谭志，吴孟茹，陈祥贵，张广峰，林琳，
申请(专利权)人：四川出入境检验检疫局检验检疫技术中心，西华大学，
类型：发明
国别省市：90