本发明专利技术公开了一种具有拮抗趋化因子受体CCR5的活性多肽，具有SEQ?ID?NO:1的氨基酸序列或者具有通过在SEQ?ID?NO:1氨基酸序列中缺失、加入、插入、替换一个或多个氨基酸残基所得到的氨基酸序列。本发明专利技术还公开了这种多肽的制备方法，包括在数据库中搜索相关蛋白质序列，进行多重对齐比较分析，筛选出vMIP-Ⅱ受体结合的高度保守区，通过分析模拟手段排除无关残基干扰，确定目的多肽序列，固相合成法合成，最后检验其生物活性。本发明专利技术的多肽可作为CCR5受体拮抗剂用于抗炎药物开发以及作为治疗艾滋病的先导药物，也可以作为免疫调节作用药物或增加机体免疫系统功能的药物应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物制药领域，具体涉及一种具有拮抗趋化因子受体CCR5的活性多 肽及其制备方法和应用。
技术介绍
艾滋病是由人类免疫缺陷病毒(HIV)侵入人体后，破坏人体免疫功能而使人体发 生一系列不可治愈的感染和肿瘤，最后导致患者死亡的传染病。艾滋病由于其传播快、难治 愈和缺乏有效的治疗药物等特点正在全世界范围内及我国较大规模地传播，已引起世界各 国高度重视，成为了二十世纪的瘟疫。但目前国内外市场尚无有效的艾滋病治疗药物，且现 有抗艾滋病药物副作用较大，价格昂贵。目前市面上的抗艾滋病药物主要是相关蛋白酶的 抑制剂，主要有逆转录酶抑制剂，其中包括核苷类逆转录酶抑制剂(NPTI)和非核苷类逆转 录酶抑制剂(NNRTI)代表药物有拉米夫定、阿巴卡韦、泰诺福韦、双肽芝、Trivizir等药物， 和蛋白酶抑制剂代表药物有奈非那韦、安普那韦、吲哚那韦、罗品那韦、利托那韦等。由于这 些药物都存在干扰人体正常酶类代谢、毒副作用较大和容易产生病毒耐药性等缺点，所以 人类要战胜艾滋病这个二十世纪的瘟疫急需要新型机制的抗病毒药物。随着对HIV感染机制研究的不断深入，科学家们对HIV病毒感染细胞的机制已经 逐步阐明。能阻断HIV感染细胞任何一个生活周期的途经都有可能用来治疗艾滋病，所以 了解HIV感染细胞机制的研究对新型抗艾滋病药物的开发十分重要。伴随着趋化因子受体作为HIV病毒进入细胞的共受体的发现，作为趋化因子受体 天然配体的趋化因子及其类似物成为了研究的热点。趋化因子是一大类能使细胞发生趋化 运动的小分子细胞因子，其作用是控制和调节白细胞的趋化运动及免疫功能，在机体的免 疫反应调节中起重要作用。趋化因子之间的结构和功能相似，分子量多在8-12KD之间，对 嗜中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞等多种细胞均有趋化作用。目前己发现的趋化因子有50 多种，它们的典型特征是有保守半胱氨酸残基的结构同源性和能与特异的G蛋白偶联的 受体结合的特性。到目前为止，许多趋化因子的三维结构已经通过X光晶体衍射和NMR核 磁共振技术的方法确定，研究结果表明趋化因子单体的三维空间结构都是高度一致的。病毒巨口耆细胞炎个生蛋白—II (virus macrophage inflammatory protein-II, vMIP-II )是由人疱疹病毒8的K4基因编码的一种病毒趋化因子，与人CC类趋化因子有较 大的同源性，是人趋化因子的类似物。vMIP - II与趋化因子受体结合后不引起胞内Ca2+迅 速内流，故不引起信号传导，从而对趋化因子与相应受体的结合起到拮抗作用。vMIP — II 和CC、C)(C趋化因子受体都能结合，所以对趋化因子有广谱的拮抗作用。vMIP-II不同于其 他趋化因子的一个独特特点是它能够拮抗包括CCR1，CCR2，CCR3，CCR5，CXCR4和CX3CR等 在内的多种趋化因子受体，特别是对CCR5和CXCR4有较高的亲和力。vMIP- II通过对HIV/SIV的共受体CCR5/CXCR4的封闭和阻断，能够有效的阻止病毒感染靶细胞，是一种比较理 想的病毒进入抑制剂。vMIP-II的广谱趋化因子受体封闭的作用，使vMIP-II成为一种广谱 的HIV进入抑制剂。多肽是一类在氨基酸构成及其连接方式上与蛋白质相同，但在某些性质方面又有 别于蛋白质的物质，如其空间结构较简单、稳定性较高、免疫原性较低或无免疫原性等。多 肽药物最理想的模式是具有人源蛋白分子的结构，以免引起免疫反应。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对现有技术中治疗艾滋病药物缺乏，提供一种具有拮抗趋化 因子受体CCR5的活性多肽。本专利技术的另一目的是提供上述多肽的制备方法。本专利技术的又一目的是提供上述多肽的应用。本专利技术通过以下技术手段实现上述目的一种具有拮抗趋化因子受体CCR5的活性多肽，命名为C25P，具有SEQ ID NO: 1的氨基 酸序列或者具有通过在SEQ ID NO: 1氨基酸序列中缺失、加入、插入、替换一个或多个氨基 酸残基所得到的氨基酸序列，具有拮抗趋化因子受体CCR5的活性。上述多肽的制备方法，包括以下步骤(1)在蛋白质数据库检索成熟形式的趋化因子序列，利用基于结构的多重序列分析，寻 找VMIP- II受体结合的高度保守区；(2)利用计算机软件进行分子模拟，预测多肽的空间结构；(3)排除无关残基的干扰，确定要合成的目标多肽的序列；(4)固相合成法合成目标多肽，纯化；(5)检验多肽的生物活性，筛选目标多肽。其中步骤(1)中，蛋白质序列检索自SWISS-PR0T蛋白质数据库，采用成熟形式 的趋化因子序列，(http://us. expasy. org/sprot)。蛋白质序列多重对齐比较分析采用 Informax Vector NTI Version 9· 0 软件包完成。步骤(2)中分子模拟采用SWISS-MODEL建模程序进行，为目前最常用、准确度最高 的建模程序。空间建模采用“First Approach Mode”过程。步骤(4 )中纯化是指用HPLC进行纯化。步骤(5)中检验多肽的生物活性包括三项实验多肽趋化和趋化抑制实验，即通 过检验多肽本身的趋化活性以及它对生理性趋化因子的阻断作用来观察多肽对受体的功 能；细胞内钙流实验，是通过研究多肽对趋化因子受体的信号转导的影响，来观察多肽对受 体的功能；抗HIV活性实验，通过细胞病毒共培养实验，来观察多肽抗SIV病毒感染细胞能 力。上述多肽作为CCR5受体拮抗剂在抗炎药物开发以及作为制备治疗艾滋病的先导 药物中的应用。上述多肽在制备免疫调节药物或增加机体免疫系统功能的药物中的应用。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果本专利技术多肽具有较好的抗趋化因子受体CCR5活性，同时能够有效保护免疫系统机能，并且免疫原性弱，还能够有效刺激机体免疫系统，增加T淋巴细胞功能，增强免疫作用。我们的研究表明，多肽C25P对PHA刺激的T淋巴细胞早期活化抗原⑶69的表达 具有促进作用；对PHA刺激的T淋巴细胞增殖也具有促进作用，并能促进T淋巴细胞进入分 裂周期，且呈剂量依赖性。提示多肽C25P对T淋巴细胞功能具有增强作用，促进其发挥免 疫效应。昆明种小鼠经长期腹腔注射多肽C25P后检测抗体滴度，并不引起昆明种小鼠产生 中和抗体，表明多肽C25P对小鼠的免疫原性较弱。多肽C25P能明显提高小鼠的胸腺指数、 脾脏指数，增加淋巴细胞转化率，T细胞计数显著性增强，并能促进细胞因子的分泌，说明多 肽C25P具有刺激小鼠免疫系统、增加T淋巴细胞功能，增强免疫的作用。多肽C25P使小鼠 外周血⑶3+、⑶4+、⑶8+ T细胞计数显著性增强，而⑶4+/⑶8+比值仍处于正常水平；同时 体外检测到小鼠血清细胞因子IL-2、IFN-Y和IL-10都有增加趋势，而且淋巴细胞凋亡无 显著变化，提示多肽C25P可能非特异性地增加机体的免疫系统功能。附图说明图1 :VMIP - II与其它CCR5受体结合因子的多重序列对比分析方框内为排除标 准，黑色圆点示高度保守的区域；图2: vMIP-II的CCR5理论结合位点在分子表面位置； 图3 =VMIP-II的CCR5理论结合位点示意图； 图4 多肽C25P分子建模，三维结构预测图； 图5 多月太C25P HPL本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种具有拮抗趋化因子受体ＣＣＲ５的活性多肽，其特征在于具有ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１的氨基酸序列或者具有通过在ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１氨基酸序列中缺失、加入、插入和／或替换一个或多个氨基酸残基所得到的氨基酸序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：孙晗笑，莫雪梅，李秀英，张光，叶石敦，何滔，汤曼莉，
申请(专利权)人：暨南大学，
类型：发明
国别省市：81
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