本发明专利技术公开了一种海洋内生拟盘多毛孢菌生产漆酶的液体发酵方法。方法的步骤为：(1)菌种筛选：从东海近海10～20m深处的泥土里筛选得到一株新型海洋真菌；(2)菌种保藏：菌种接种于修饰的PDA培养基中培养，并于4℃下斜面保藏；(3)菌种活化和扩培：菌种的孢子接种于添加了特殊成分的PDA培养基，活化得到的孢子接种于种子培养基中进行扩培；(4)制备海洋内生拟盘多毛孢菌液体发酵培养基；(5)发酵：采用新配制的培养基进行液体发酵和产酶，确定了优化的产酶条件。本发明专利技术所开发的生产漆酶的方法，以新型的海洋内生拟盘多毛孢菌为产生菌，具有培养基粗狂、来源广泛和价廉等特点。
【技术实现步骤摘要】
【技术保护点】
１．一种海洋内生拟盘多毛孢菌生产漆酶的液体发酵方法，其特征在于它的步骤如下：１）菌种筛选：从东海１０～２０ｍ深的海水底取污泥、海草样品，取样品５～１０ｇ加入灭菌人工海水５０ｍｌ，１６０～２５０ｒ／ｍ转速下振荡２０～３０ｍｉｎ，静置１０～２０ｍｉｎ取上清液０．２５～０．５ｍｌ，涂布ＰＤＡ平板，２６～３０℃，培养１５～２０天；挑取菌落，接种于分离选择培养基，２６～３０℃培养，若分离得到产漆酶的菌株，则会在含愈创木酚的选择培养基上因愈创木酚的氧化而显示出红棕色，颜色越深，范围越大表明菌株产漆酶的能力越强，将产漆酶的菌株接种于液体产酶培养基进行发酵培养，２６～３０℃培养８～１２天测定漆酶活，选取漆酶活力高的为目的菌种，依据菌种的ＩＴＳ分析和菌种的形态特征鉴定，得到一株新型的海洋真菌－海洋内生拟盘多毛孢菌作为发酵菌种，其中，分离选择培养基的组成为：愈创木酚１ｇ，酒石酸铵０．１ｇ，蛋白胨２．６ｇ，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ １ｇ，Ｎａ２ＨＰＯ４ ０．２ｇ，琼脂１８ｇ，加人工海水至１０００ｍｌ，菌种保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为ＣＣＴＣＣ Ｍ ２０１０３００，保藏日为２０１０年１１月１３日，分类命名为ｐｅｓｔａｌｏｔｉｏｐｓｉｓｓｐ．ｊ６３；２）菌种保藏：把内生拟盘多毛孢菌接种于ＰＤＡ培养基上，２６～３０℃下培养６～１０天，斜面保藏于４℃，保藏期限为３０天，保藏３０天后重复传代保藏；３）菌种活化：在ＰＤＡ培养基中添加新的成分形成ＰＤＡ－ａ培养基，新添加的成分为２００ｇ马铃薯经１升人工海水煮沸３０ｍｉｎ后的滤液和葡萄糖１０～２０ｇ，在２６～３０℃下培养６～１０天，完成活化，得到活化的内生拟盘多毛孢菌，人工海水组成为：ＮａＣｌ ２９．８ｇ，ＭｇＳＯ４ ５．４ｇ，ＫＣｌ ０．７３ｇ，ＭｇＣｌ２．６Ｈ２Ｏ １０．７ｇ，ＣａＣｌ２ ０．８３０６ｇ，蒸馏水１．０Ｌ；４）种子培养基：将活化的内生拟盘多毛孢菌株挑取少量菌丝接种到种子培养基中进行扩培，得到内生拟盘多毛孢菌的一级种子液，种子培养基的组成为：葡萄糖６～１２ｇ，酒石酸铵１～４ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ ０．５～２ｇ，Ｎａ２ＨＰＯ４ ０．２ｇ，微量元素液５～１５ｍｌ，酵母提取物：１～４ｇ，调ｐＨ至４．５～６．０，用人工海水定容至１０００ｍｌ，２６～３０℃下培养２～４天，其中，微量元素溶液的组成为：ＭｇＳＯ４·５Ｈ２Ｏ ０．５ｇ／Ｌ，ＦｅＳＯ４ ０．２ｇ／Ｌ，ＺｎＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０．０１ｇ／Ｌ，ＭｎＣｌ２·４Ｈ２Ｏ ０．００３ｇ／Ｌ，Ｈ３ＢＯ４ ０．０３ｇ／Ｌ，ＣｏＣｌ２·６Ｈ２Ｏ ０．０２ｇ／Ｌ；５）发酵产酶培养基：内生拟盘多毛孢菌的一级种子液按５～１０％体积比接种量接种于液体发酵产酶培养基，温度２６～３０℃、装液量３０～４０％、起始ｐＨ ４．５～６．０、转速１２０～２００ｒ／ｍ发酵６～１０天，得到４７５７ＩＵ／ｍｌ的漆酶；其中，液体发酵产酶培养基组成为：不同的碳源组合，酒石酸铵１～４ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ ０．５～２ｇ，Ｎａ２ＨＰＯ４ ０．２ｇ，ＣｕＳＯ４·５Ｈ２Ｏ１５０～２５０μＭ，微量元素液１０～１５ｍｌ，酵母提取物１～４ｇ，调ｐＨ至４．５～６．０，用自来水定容至１０００ｍｌ。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：姚善泾，陈慧英，冯晓雨，薛栋升，林东强，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：86
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