重组对虾蛋白SF-P9及制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种重组对虾蛋白SF-P9及制备方法和用途，编码该重组对虾蛋白SF-P9的氨基酸序列及其对应的DNA序列，含该DNA序列的酵母重组基因工程菌株PichiapastorisX-33/pPIC6αA/Pen，CCTCCNo:M209126，利用该工程菌株表达重组对虾蛋白SF-P9。本发明专利技术还公开了一种对虾蛋白F-P6及制备方法和用途，编码该对虾蛋白Pen6的氨基酸序列及其对应的DNA序列。重组对虾蛋白SF-P9中含有肠激酶位点，经肠激酶酶切后获得对虾蛋白F-P6。对虾蛋白SF-P9和F-P6具有明显的抗细菌、抗真菌和抗病毒感染的生物活性。对虾蛋白SF-P9和F-P6具有明显的抑制肿瘤细胞生长的作用。对虾蛋白SF-P9和F-P6在制备治疗或预防动物和植物的细菌、真菌和病毒病药物、抗肿瘤药物中的用途。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因工程技术、药物，以及动物、植物病害防治领域。更具体涉及一种含有对虾肽基因penaeidine的重组基因工程菌株PicAia pas tor is X-33/pPIC6 α A/Pen, 一种重组对虾蛋白SF-P9的氨基酸序列及其对应的DNA序列，一种对虾蛋白F-P6的氨基酸序列及其对应的DNA序列，以及含对虾蛋白SF-P9和F-P6的药物组合物。同时还涉及一种表达重组对虾蛋白SF-P9的酵母重组基因工程菌株/7ZcAia pas tor is X_33/pPIC6 α A/Pen 的构建方法，本专利技术涉及的对虾蛋白SF-P9和F-P6具有明显的抗革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌感染的生物学活性，以及抗真菌感染活性和抗病毒感染的生物学活性，同时还涉及对虾蛋白SF-P9和F-P6具有抑杀肿瘤细胞的生物学活性。对虾蛋白SF-P9和F-P6作为制备治疗或预防动物和植物的细菌、真菌、病毒病和肿瘤病的药物中的用途，同时还涉及对虾蛋白SF-P9和F-P6在医药、化妆品、食品、饲料等产品制剂中的用途。
技术介绍
抗菌肽广泛分布于哺乳动物、两栖动物、甲壳动物、软体动物、植物和昆虫等多种生物体内(Ryan et al. , 1998, Harder et al. , 1997, Chan et al. , 1996, Destoumieux et al.,1997, Chan Bae Park. , 1997, Francisco et al. , 1998, Cociancich et al.，1994)。 抗菌肽是特定基因编码的一类小分子多肽，具有广谱高效的抗细菌活性，某些抗菌肽还具有抗真菌、抗原虫、抗病毒、抗肿瘤细胞的功能(张永莲等，2002，Michael C et al., 2003Leuschner et al，2004，Mader et al，2005)。对虾抗菌肽Penaeidin是普遍存在于对虾中的一类活性物质。在大西洋白对虫下(Litopenaeus setiferus)、斑节对虫下(Peneaus monodon)、中国对虫下(Fenneropenaeus chinensis)禾口曰本对虫下(Penaeus japonicus)等甲壳动物中均有 Penaeidins0 Penaeidin 在虾类的先天免疫应答中具有重要的作用(BachSre et al，2004)。目前，已发现PEN2、 PEN3、PEN4 (PenBase V2. 1) 3 个亚群(subgroup)。Penaeidins在一级、二级结构上具有抗菌肽的基本共性，但在结构和生物学功能上的共同特征是(1)分子量小。(2)都是阳离子肽(等电点分别为9. 34，另一个的等电点为 9. 84)。(3)N-端富含脯氨酸Pro，推测Penaeidins富含脯氨酸的N-端结构介导Penaeidin 与靶细胞的相互作用而非直接发挥抗菌活性。同时，Penaeidins的富含脯氨酸结构域决定了抗微生物肽的靶微生物的种类特异性。(4) C-端富含半胱氨酸Cys，C端含有6个半胱氨酸，具有3个分子内二硫键，C端成环状(Destoumieux et al，1997)。C-端富含Cys区域表面具有抗菌活性所必需的疏水性特点，从而Penaeidins具有对革兰氏阳性菌G+和革兰氏阴性菌G-的广谱抗菌活性。(5)PenaeidinS C-端区域具有一个保守的几丁质结合模体，具有粘合几丁质的特性(BachSre et al，1999)。Penaeidins通过与真菌细胞壁上的几丁质相互作用而发挥其抗真菌活性。(6) Penaeidins具有翻译后修饰的特性，如成熟 Penaeidin-2和Penaeidinla的C-端以酰胺化形式存在，这种翻译后修饰可能与稳定蛋白的螺旋结构，增强多肽与细胞膜之间的静电作用相关。(7) Penaeidins的N端和C端可协同作用。Penaeidins的N端带正电，自由伸展，该区域先微弱地锚定到细胞膜上。由于C 端具有疏水性，高度稳定，故C端与细胞膜的疏水相互作用加强这种锚定效果。最后，肽链粘贴在细胞膜表面，或者插入膜上的孔洞而发挥作用(Yang et al，2003)。两种结构域的协同作用决定了 penaeidin对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的广谱抗菌活性。对虾肽 penaeidin具有抗细菌、抗真菌、抗病毒、抗肿瘤的作用(Destoumieux et al, 1999，Cuthbertson et al，2002)。同时，Penaeidin参与噬菌细胞对细菌的识别过程， 使细菌凝聚，增强免疫细胞的能力(Munoz et al，2002)。对虾肽penaeidin具有广阔的应用前景。传统抗生素通过阻断大分子生物合成的机制而发挥抗菌活性。目前，致病菌的抗药性日益严重，迫使人们寻找新一代的抗菌药代替抗生素。Penaeidins具有广谱抗菌作用， 其抗菌机理独特，不易导致病原体耐药性。同时，Penaeidins分子较小，对热稳定，水溶性好，对宿主无毒副作用。Penaeidins有望成为一类无毒、无残留的新型抗菌、抗病毒、抗肿瘤药物。Penaeidins还可作为一种新型环保的饲料添加剂，并改善养殖水体。
技术实现思路
在本专利技术的第一个方面，提供了一种重组对虾蛋白SF-P9，一种表达重组对虾蛋白 SF-P9的酵母基因工程菌株，重组对虾蛋白SF-P9的制备方法，一种含有效剂量重组对虾蛋白SF-P9的药物组合物，以及重组对虾蛋白SF-P9在制备治疗或预防抗细菌感染药物、抗真菌感染药物、抗病毒感染药物、抗肿瘤药物中的应用。本专利技术的一个目的在于提供了一种重组对虾蛋白SF-P9，该蛋白包括SEQ ID No. 2 所示的氨基酸序列。本专利技术的目的之一在于提供了一种DNA分子，该DNA分子编码上述的重组对虾蛋白SF-P9。较佳的，所述的DNA分子编码包括SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列的融合蛋白。 更佳的，所述的DNA分子包括SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列。本专利技术的目的之一在于提供一种含有南美白对虾Penaeidin基因的重组基因工程酵母菌株，其特征在于该菌株是一种高效、分泌表达重组对虾蛋白SF-P9的重组基因工程菌株/7ZcAia pas tor is X_33/pPIC6 α A/Pen，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No: M209126。利用该基因工程菌株PicAia pas tor is X-33/ pPIC6 α A/Pen，可高效、稳定地分泌表达基因工程重组对虾蛋白SF-P9。本专利技术在构建对虾肽penaeidin基因工程菌株、表达对虾抗菌肽的同时，采取融合蛋白表达方式，选择毕赤酵母X-33宿主，构建了对虾肽penaeidin分泌型表达载体，构建了毕赤酵母重组基因工程菌株PicAia pastor is X_33/pPIC6 α A/Pen。利用毕赤酵母重组基因工程菌株/7ZcAia pastor is X_33/pPIC6 α A/Pen,分泌表达了重组融合对虾蛋白SF-P9。本专利技术的目的之一是在于提供了一种表达重组对虾蛋白SF-P9的酵母重组基因工程菌株/7ZcAia pas本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种基因工程表达、分离和纯化的重组对虾蛋白ＳＦ－Ｐ９，其序列为ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．２所示氨基酸序列。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：徐进平，孟小林，王健，唐检秀，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：83