用于分析的细胞和生物学标本的稳定制造技术

披露了用于稳定血液标本中的罕见细胞，保持血液标本的质量，以及还可用作细胞固定剂的组合物和方法，所述组合物和方法能减少靶细胞（例如，循环的肿瘤细胞）的损失，和由靶细胞，非靶细胞和血浆成分形成碎片和聚集物，以便能够更精确地分析循环的肿瘤细胞（ＣＴＣ），并对它们进行分类，并且最终分析癌症患者的肿瘤负担。在需要对来自从癌症患者抽取的血液标本中富集罕见细胞的方法中，标本的稳定化是特别必要的。业已发现，让所述标本接触有可能遇到的胁迫条件，例如正常的加工，混合，震荡，由转运血液所导致的延迟，不仅会减少ＣＴＣ的数量，而且还能在血液标本中产生碎片和聚集物，发现如果存在所述碎片和聚集物的话，会干扰对靶细胞的精确计数。为了区分体内ＣＴＣ分解和体外样品降解，稳定剂是必需的。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

Stability of cells and biological specimens for analysis

For the rare cell stability in blood specimens is disclosed, to maintain the quality of blood samples, and also can be used as a cell composition and method of fixing agent, said composition and method can reduce the target cells (e.g., circulating tumor cells) loss, and by non target cells, target cells and plasma components into fragments and aggregation and in order to be able to more accurately analyze circulating tumor cells (CTC), and to classify them, and the final analysis of cancer patients with tumor burden. In the need for methods of enriching rare cells from blood samples taken from cancer patients, the stabilization of the specimen is particularly necessary. It has been found that the specimen contact may encounter stress conditions, such as normal processing, mixing, shock caused by blood transport delay will not only reduce the number of CTC, but also can produce fragments and aggregates in blood samples, found that if the presence of the debris and aggregates, will precise counting on target cell interference. In order to distinguish between in vivo CTC decomposition and in vitro sample degradation, stabilizers are required.

【技术实现步骤摘要】
本申请总体上涉及细胞和血液稳定领域，更具体地讲，涉及血液标本中罕见细胞的稳定，最具体地讲涉及全血中循环的肿瘤细胞(CTC)的稳定，以便随后富集和分析。
技术介绍
早在1869年就已经在血液中检测到肿瘤细胞，有证据表明，原发性癌症在出现临床症状之前的早期发病阶段就开始向循环系统中脱落肿瘤细胞。在肿瘤血管化时，脱落到循环系统中的肿瘤细胞可以附着，并且定居在远处的部位，以便形成转移肿瘤。所述循环的肿瘤细胞正常情况下不存在于健康个体内，因此可以构成用于诊断和治疗特殊癌的基础。当肿瘤生长到1-2毫米的直径时就开始发生新的血管化，肿瘤的这种尺寸太小，以至不能通过诸如乳房X光照相的常规方法检测，该方法要求肿瘤的尺寸大约为5毫米，以便检测。能够在以现有金标准乳房X光照相方法更早的阶段检测少量CTC的具有灵敏性和专一性的检测方法，能够显著改善早期癌症诊断和疾病控制。Terstappen等在US6365362中披露了这种检测方法，该专利被收作本文参考。全血是一种复杂的体液，它含有各种细胞群体和能够进行各种生物化学和酶促反应的可溶性成分，所述反应特别是在超过6小时的体内长期保存时可能发生，体内在本文中被定义为是在患者身体内发生的；以及在体外发生，体外在本文中被定义为是在抽血之后发生的。上述某些反应的结果是作为异源物质破坏循环的肿瘤细胞检测的。患者的免疫反应还可以通过包括吞噬作用和嗜中性白细胞活化在内的正常防御机制削弱或破坏肿瘤细胞。化疗同样可以通过由坏死诱导的细胞死亡减弱细胞功能和增殖。除了上述外部破坏因素之外，在敌对环境中受到损伤的肿瘤细胞还可能发生细胞程序死亡或凋之。发生凋亡或坏死的细胞，具有改变了的膜通透性，以便能够排出DNA，RNA和其他细胞成分，导致细胞碎片的形成，并且最终导致CTC的完全分解。所述肿瘤细胞碎片可能仍然具有完整细胞所特有的表位，并且可能导致循环癌细胞的疑似增加。即使是来自健康个体的全血标本也会发生细胞组成的明显改变，这种改变被广义地归类为，并且在本文中被确定为血液质量的降低，这种现象可能在超过24小时的长时间保存时发生。红细胞可能破裂，并且释放血红蛋白和产生细胞血影。已知白细胞，特别是粒细胞是不稳定的，并且会在保存时减少。所述改变增加了源于正常血细胞的细胞碎片的数量或者发现蛋白会干扰诸如CTC的罕见靶细胞的分离和检测。所述破坏性过程的综合作用表现出细胞碎片的显著增加，这些碎片能够方便地检测，例如通过流式细胞测定和显微技术分析，用于所述分析的方法披露于共同拥有的题为“循环肿瘤细胞、片段和碎片的分析”的共同未决申请中，该申请被收作本文参考。通过显微成像检测循环的肿瘤细胞同样会受到可分类的肿瘤细胞的疑似减少和干扰可染色碎片的相应增加的不利影响。因此，保持血液标本的完整性或质量是最重要的，因为在出血和标本加工之间可能存在多达24小时的延迟。所述延迟是相当常见的，因为并不是在每一个实验室中都具备进行用于加工用于该测定的技术和设备。样品送达样品加工实验室所需要的时间有很大的不同。因此，重要的是确定可以加工样品的时间窗。在常规血液学分析中，血液样品可以在24小时内分析。由于罕见血细胞的分析更为严格，缩短了可以分析血液样品的时间窗。一种例子是血细胞的免疫表型分类，一般，该方法必须在24小时内进行。在癌症血液测定中，必须对更大体积的血液进行加工，并且血液样品的降解可能造成更严重的问题，因为由分解的细胞释放的材料能加强背景，并因此降低检测肿瘤细胞的能力。有大量公开的或获得专利的技术涉及到正常血液细胞长时间保存的稳定性和稳定化，有若干种获得专利的商业化稳定剂可用于保存白血细胞，例如由Streck Laboratories，Omaha，NE出售的Cyto-ChexTM，由BioErgonomics，St.Paul出售的StabilCyteTM，和由UK NEQAS，Sheffield，UK出售的TRANSfixTM。在WO 97/45729中，声称TRANSfixTM稳定剂适用于分析病理学标本，特别是分析HIV和白血病血液标本。不过，没有公开所述申请的资料，或公开将TRANSfixTM用于在长时间保存期间稳定和保护CTC的用途。所述文献声称TRANSfixTM含有交联固定剂，低聚甲醛和重金属离子。通过流式细胞测定方法测定发现，可以将包括粒细胞在内的白细胞的完整性保持至少5天时间。没有发表有关CTC或其他病原体的资料。尽管低聚甲醛或含有低聚甲醛、甲醛、戊二醛和乙二醛的试剂存在缺陷，这种试剂通常被用于固定和稳定血液或组织学标本中的肿瘤细胞(例如，参见D.B.Tse等，US6,004,762)。在用成孔试剂，如皂苷，或表面活性剂对CTC进行透化之后，有效固定是特别重要的。所述透化会进一步削弱脆弱的CTC的细胞膜结构和细胞完整性。为了对细胞内成分进行染色或免疫染色，透化是必要的，例如，用细胞核染料DAPI(4，6-二氨基-2-苯基吲哚)和使用标记过的抗体，如细胞角蛋白，将所述染色剂用于表征CTC，并且将它们与正常血液细胞区分开来。业已使用了替代双功能或交联醛类的固定剂。某些较老的固定剂是基于重金属的，例如铬或锰，类似于皮毛鞣制中的作用模式，但是，由于它们缺乏特异性和毒性，限制了它的应用。固定的另一种方法使用了甲醛的单功能衍生物，或杂环胺或酰胺的羟甲基衍生物，例如，二偶氮烷基脲和咪唑烷基脲，这两种物质被广泛用作化妆品中的防腐剂。另外，业已披露聚乙二醇(大约20000MW)，是白细胞的有效稳定剂。所述化合物披露于被授予Streck Laboratories，Omaha，NE的若干美国专利中(US 5,459,073；US 5,849,517；US 5,981,282；US 6,017,764；US 6,051,433；US 6,124,089；6,159,682；US6,200,500)，这种化合物主要被用于稳定特殊的血液细胞群体，以便用作血液学的对照。羟甲基衍生物的作用模式是未知的，不过，根推测与和细胞蛋白的氨基基团之间的弱的可恢复的键相关，所述结合在除去多余的固定剂之后会解离。羟甲基或羟基甲基衍生物在化学上是易变的，并且能够释放少量的甲醛，这些甲醛能与蛋白形成短的或单一的碳交联。据报导，由所谓的甲醛供体释放的甲醛能与核酸碱基起反应，特别是与腺嘌呤起反应，以便可逆地形成羟甲基衍生物和亚甲基桥，以便不可逆地交联核酸，这可能是在化妆品中起作用的抗生模式。不过，据说游离的甲醛在上述专利的Cyto-ChexTM稳定剂中不是有效成分。以上专利没有披露稳定或固定血液或其他生物学标本中的CTC的用途。人们无法推测在血液中循环的肿瘤细胞会像正常的血液细胞那样稳定。因为已知CTC具有脆弱性，并且CTC的任何稳定化(如果发生这种稳定的话)会在所有加工步骤中持续。因此，明确需要鉴定能在储存和加工期间体外稳定CTC的有效试剂，以及能保持血液品质的试剂，在本文中，我们业已证实这种试剂在需要对CTC进行精确分类和计数(如果存在的话)的富集和检测方法中是重要的。专利技术概述为了区分体内肿瘤分解和由于体外样品降解所导致的分解，稳定剂是必须的。根据本专利技术，业已发现了可以用作保持生物学标本质量的稳定剂、固定剂和防腐剂的若干种组合物。另外，业已发现了用于稳定生本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于保存生物学标本的组合物，由以下成分组成：ａ．抗凝剂，和ｂ．稳定剂。

【技术特征摘要】
US 2001-8-23 60/314,151;US 2002-4-3 60/369,6281.一种用于保存生物学标本的组合物，由以下成分组成a.抗凝剂，和b.稳定剂。2.如权利要求1的组合物，其中，所述抗凝剂是螯合剂。3.如权利要求2的组合物，其中，所述抗凝剂选自下组乙二胺四乙酸(EDTA)，二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)，1，2-二氨基环己烷四乙酸(DCTA)，和亚乙基双(氧亚乙基次氮基)四乙酸(EGTA)。4.如权利要求1的组合物，其中，所述抗凝剂是配合剂。5.如权利要求4的组合物，其中，所述抗凝剂选自肝素和柠檬酸盐。6.如权利要求1的组合物，其中，所述稳定剂是甲醛供体。7.如权利要求6的组合物，其中，所述甲醛供体选自下组胺或酰胺的羟甲基或羟基甲基衍生物，二偶氮烷基脲，咪唑烷基脲，乌洛托品，和低聚甲醛。8.如权利要求1的组合物，其中，所述稳定剂是醛。9.如权利要求8的组合物，其中，所述醛类选自下组甲醛，戊二醛和乙二醛。10.如权利要求1的组合物，其中，所述稳定剂是甲醛供体或与至少一种重金属元素结合的醛类。11.如权利要求10的组合物，其中，所述重金属元素选自下组铬、锰和锌。12.如权利要求1的组合物，其中，另一种稳定剂是聚乙二醇。13.如权利要求12的组合物，其中，所述聚乙二醇的分子量范围为大约1000-大约35000。14.如权利要求12的组合物，其中，所述聚乙二醇的分子量范围为大约5000-大约20000。15.如权利要求12的组合物，其中，所述聚乙二醇的分子量范围为大约8000-大约20000。16.一种用于保存被怀疑含有循环的肿瘤细胞的血液标本的组合物，由以下成分组成a.抗凝剂，和b.稳定剂。17.如权利要求16的组合物，其中，所述抗凝剂是螯合剂。18.如权利要求17的组合物，其中，所述抗凝剂选自下组乙二胺四乙酸(EDTA)，二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)，1，2-二氨基环己烷四乙酸(DCTA)，和亚乙基双(氧亚乙基次氮基)四乙酸(EGTA)。19.如权利要求16的组合物，其中，所述抗凝剂是配合剂。20.如权利要求19的组合物，其中，所述抗凝剂选自肝素和柠檬酸盐。21.如权利要求16的组合物，其中，所述稳定剂是甲醛供体。22.如权利要求21的组合物，其中，所述甲醛供体选自下组胺或酰胺的羟甲基或羟基甲基衍生物，二偶氮烷基脲，咪唑烷基脲，乌洛托品，和低聚甲醛。23.如权利要求16的组合物，其中，所述稳定剂是醛类。24.如权利要求23的组合物，其中，所述醛类选自下组甲醛，戊二醛和乙二醛。25.如权利要求16的组合物，其中，所述稳定剂是甲醛供体或与至少一种重金属元素结合的醛类。26.如权利要求25的组合物，其中，所述重金属元素选自下组铬、锰和锌。27.如权利要求16的组合物，其中，另一种稳定剂是聚乙二醇。28.如权利要求27的组合物，其中，所述聚乙二醇的分子量范围为大约1000-大约35000。29.如权利要求27的组合物，其中，所述聚乙二醇的分子量范围为大约5000-大约20000。30.如权利要求27的组合物，其中，所述聚乙二醇的分子量范围为大约8000-大约20000。31.一种稳定化细胞组合物，由以下成分组成a.生物学标本，b.抗凝剂，和b.稳定剂。32.如权利要求31的稳定化细胞组合物，其中，所述生物学标本是怀疑含有循环的肿瘤细胞的血液部分。33.如权利要求32的稳定化细胞组合物，其中，所述循环的肿瘤细胞业已通过所述稳定剂稳定化。34.如权利要求31的稳定化细胞组合物，其中，所述抗凝剂是螯合剂35.如权利要求34的稳定化细胞组合物，其中，所述抗凝剂选自下组乙二胺四乙酸(EDTA)，二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)，1，2-二氨基环己烷四乙酸(DCTA)，和亚乙基双(氧亚乙基次氮基)四乙酸(EGTA)。36.如权利要求31的稳定化细胞组合物，其中，所述抗凝剂是配合剂。37.如权利要求36的稳定化细胞组合物，其中，所述抗凝剂选自肝素和柠檬酸盐。38.如权利要求31的稳定化细胞组合物，其中，所述稳定剂是甲醛供体。39.如权利要求38的稳定化细胞组合物，其中，所述甲醛供体选自下组胺或酰胺的羟甲基或羟基甲基衍生物，二偶氮烷基脲，咪唑烷基脲，乌洛托品，和低聚甲醛。40.如权利要求31的稳定化细胞组合物，其中，所述稳定剂是醛类。41.如权利要求40的稳定化细胞组合物，其中，所述醛类选自下组甲醛，戊二醛和乙二醛。42.如权利要求31的稳定化细胞组合物，其中，所述稳定剂是甲醛供体或与至少一种重金属元素结合的醛类。43.如权利要求42的稳定化细胞组合物，其中，所述重金属元素选自下组铬、锰和锌。44.如权利要求31的稳定化细胞组合物，其中，另一种稳定剂是聚乙二醇。45.如权利要求44的稳定化细胞组合物，其中，所述聚乙二醇的分子量范围为大约1000-大约35000。46.如权利要求44的稳定化细胞组合物，其中，所述聚乙二醇的分子量范围为大约5000-大约20000。47.如权利要求44的稳定化细胞组合物，其中，所述聚乙二醇的分子量范围为大约8000-大约20000。48.如权利要求31的稳定化细胞组合物，其中，所述抗凝剂和所述稳定剂是以占所述生物学标本总体积大约0.1-大约50％的体积添加的。49.如权利要求47的稳定化细胞组合物，其中，所述体积占所述生物学标本总体积大约0.3-大约30％。50.如权利要求47的稳定化细胞组合物，其中，所述体积占所述生物学标本总体积大约0.3-大约5％。51.一种用于保存生物学标本的方法，由以下步骤组成a.获得包括细胞的生物学标本，和b.让所述生物学标本与能够稳定所述细胞的稳定剂接触。52.如权利要求51的方法，其中，所述稳定剂是甲醛供体。53.如权利要求52的方法，其中，所述甲醛供体选自下组胺或酰胺的羟甲基或羟基甲基衍生物，二偶氮烷基脲，咪唑烷基脲，乌洛托品，和低聚甲醛。54.如权利要求51的方法，其中，所述稳定剂是醛类。55.如权利要求54的方法，其中，所述醛类选自下组甲醛，戊二醛和乙二醛。56.如权利要求51的方法，其中，所述稳定剂是甲醛供体或与至少一种重金属元素结合的醛类。57.如权利要求56的方法，其中，所述重金属元素选自下组铬、锰和锌。58.如权利要求51的方法，其中，另一种稳定剂是聚乙二醇。59.如权利要求58的方法，其中，所述聚乙二醇的分子量范围为大约1000-大约35000。60.如权利要求58的方法，其中，所述聚乙二醇的分子量范围为大约5000-大约20000。61.如权利要求58的方法，其中，所述聚乙二醇的分子量范围为大约8000-大约20000。62.如权利要求51的方法，其中，所述标本还与一种抗凝剂接触。63.如权利要求62的方法，其中，所述抗凝剂是螯合剂。64.如权利要求63的方法，其中，所述抗凝剂选自下组乙二胺四乙酸(EDTA)，二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)，1，2-二氨基环己烷四乙酸(DCTA)，和亚乙基双(氧亚乙基次氮基)四乙酸(EGTA)。65.如权利要求62的方法，其中，所述抗凝剂是配合剂。66.如权利要求65的方法，其中，所述抗凝剂选自肝素和柠檬酸盐。67.如权利要求62的方法，其中，所述抗凝剂和所述稳定剂是在接触生物学标本之前混合的。68.如权利要求67的方法，其中，所述抗凝剂是螯合剂。69.如权利要求68的方法，其中，所述抗凝剂选自下组乙二胺四乙酸(EDTA)，二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)，1，2-二氨基环己烷四乙酸(DCTA)，和亚乙基双(氧亚乙基次氮基)四乙酸(EGTA)。70.如权利要求67的方法，其中，所述抗凝剂是配合剂。71.如权利要求70的方法，其中，所述抗凝剂选自肝素和柠檬酸盐。72.如权利要求67的方法，其中，所述抗凝剂和所述稳定剂的体积占所述生物学标本总体积的大约0.1-大约50％。73.如权利要求72的方法，其中，所述体积占所述生物学标本总体积的大约0.3-大约30％。74.如权利要求72的方法，其中，所述体积占所述生物学标本总体积的大约0.3-5％。75.一...

【专利技术属性】
技术研发人员：GC劳，M赫尔曼，H鲁特纳，L特尔斯塔彭，
申请(专利权)人：免疫公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]