源于非造血组织的非胚胎细胞的保存制造技术

本发明专利技术涉及来源于脂肪组织的被低温保存的含有干细胞和祖细胞的细胞群、回收和存储这些细胞群的方法和这些细胞群在解冻后的治疗用途。本发明专利技术进一步涉及结缔组织基质，它可从脂肪组织中提取，经过保存后用于哺乳动物患者的治疗、结构性或美容用途。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

Preservation of non embryonic cells derived from non hematopoietic tissue

The present invention relates to a method for the cryopreservation of stem cells and progenitor cells derived from adipose tissue, a method for the recovery and storage of these cell populations, and the therapeutic use of these cell populations after thawing. The invention further relates to a connective tissue matrix, which can be extracted from adipose tissue and used for the treatment, structural or cosmetic use of a mammalian patient.

【技术实现步骤摘要】
源于非造血组织的非胚胎细胞的保存的制作方法本申请要求2001年9月14日提交的美国临时专利申请60/322,070的权益。本专利技术涉及脂肪组织来源的细胞群，特别是源自脂肪组织的干细胞和祖细胞，它们可被低温保存备用并将低温保存的细胞用于疾病治疗。本专利技术也涉及结缔组织基质的制备和存储，所述基质是从脂肪组织中提取的；本专利技术也涉及这些材料在存储后的治疗和美容用途。这些细胞群和基质可用于不同疾病或不适的患者的治疗、构建和/或美容方法。优选方案中，低温保存的细胞解冻后，可用于自身修复、重组(reconstitution)、重建(reconstruction)以及诊断应用。本专利技术还涉及本专利技术的干细胞、祖细胞以及结缔组织的收集、处理和低温保存的方法。虽然本文所述的方法以及回收和保存的材料主要是给人用的，但它们也可以用于兽医学，能够用于其它的哺乳动物。
技术介绍
组织工程(tissue engineering)组织工程是特定的术语，通常是指用生物组织构建单元来再生、修复或重建受损的或有缺陷的身体结构或器官。比如，有望通过生长新心脏组织治疗心脏病发作，或用成骨细胞治疗骨折愈合缓慢。组织工程的核心构建单元是(1)细胞，优选的细胞具有高增殖性和分化能力，能够以使用者定义的方式制备大量的多种不同的组织；(2)支架结构(scaffolds)，提供组织在其上发育的三维结构，这类结构可以是天然的、人工的或复合材料；(3)生长因子和化学药物，能够使细胞利用支架结构并生成新的或修复的组织。本专利技术的目的是提取脂肪组织，分离该脂肪组织中的目的组分，然后保存上述前两种构建单元，即脂肪组织来源的细胞群和结缔组织基质，其中所述细胞群包括干细胞和祖细胞，而结缔组织材料是天然的支架结构。
技术介绍
干细胞和祖细胞干细胞是身体的母细胞(Blau HM，TR Brazelton和JM Weimann“干细胞的进化概念实体或功能？”，Cell，105，p829-841，(2001))。已知源于胚胎的干细胞或胚胎干细胞(ESCs)能够发育成身体的多种甚至全部的细胞或组织类型。这些ESCs，也称早期胚胎细胞，不仅包含了个体的全部遗传信息，而且还具有生成200多种不同身体细胞和组织的新生能力。进一步的研究表明这些细胞具有巨大的科学和临床应用价值(Weissman IL“干细胞和祖细胞生物学向临床的转变困难和机会”，Science 287，p1442-1446，(2000))。然而，ESCs的应用有其理论上的局限性。如果临床使用，它们必须是源于同一个体的胚胎。当源于某人的干细胞或组织移植给另外一个人时，可能需要给细胞接受者使用有毒的免疫抑制剂，以防止排斥反应。另外，来自某个体的细胞可能携带病毒或其它罕见但重要的疾病。而且，已知ESC样细胞(如畸胎瘤)能够形成肿瘤。从ESCs发育的、给患者使用的任何组织，必须是不能致瘤的，且具有天然的对正常信号应答的能力，这些信号使组织生长、停止生长或愈合。最近，已经鉴定出一些非胚胎或“成熟”干细胞，它们是ESCs临床应用的重要的潜在的备选细胞(Pittenger MF，Mackay AM，BeckSC，Jaiswal RK，Douglas R.Mosca JD，Moorman MA，Simonetti DW，Craig S和Marshak DR“成人间质干细胞的多谱系潜能”，Science，284，p143-147(1999)；Zuk PA，Zhu M，Mizuno H，Huang J Futrell JW，KatzAJ，Benhaim P，Lorenz HP和Hedrick MH“来自人脂肪组织的多谱系细胞适于基于细胞的治疗”Tissue Eng 7，p211-218，(2001))。这些细胞隐秘地定位于多种组织甚至所有组织中，推测其准备应答创伤或其它破坏性疾病过程，这样它们就能治愈受损的组织。新出现的科学证据提示每个个体都带有一定数量的(a pool of)干细胞，它们同ESCs一样具有发育为多种甚至全部类型的细胞或组织的能力。祖细胞是一类介于干细胞和成熟细胞之间的中间细胞。通常这些细胞发育为多种成熟细胞类型的能力被进一步的限制，而且其增值能力也有相当大的局限性或无自我更新能力。祖细胞的实例包括造血系统的CFU-GM和BFU-E细胞，以及间质系统的前脂肪细胞和前成骨细胞。作为组织工程的细胞来源的脂肪组织最近发现脂肪组织是适于治疗应用的干细胞、祖细胞和基质的来源(Zuk等，同前；Huang JI，SR Beanes，Zhu M，HP Lorenz，Hedrick MH和Benhaim P“作为成骨软骨祖细胞的来源的大鼠髓外脂肪组织”Plast Reconstr Surg.109；p1033-1041；discussion，p1042-1043，(2002)；Mizuno H，Zuk PA，Zhu M，Lorenz HP，Benhaim P和Hedrick MH“处理过的人吸脂细胞的成肌分化”.Plast Reconstr Surg.109p199-209；discussion 210-1(2000))。脂肪组织同时也是血管内皮细胞的丰富来源(Kern PA，Knedler A和Eckel RH“来自人脂肪组织的微血管内皮细胞的分离和培养”，J Clin Invest 71，p1822-1829，(1983))，这些细胞在通过促进新血管生长和刺激干细胞与祖细胞生长而进行组织再生以及工程化方面有一定的作用(Hutley LJ，Herington AC，Shurety W，CheungC，Vesey DA，Cameron DP和Prins JB“人脂肪组织内皮细胞促进前脂肪细胞增殖”Am J Physiol Endocrinol Metab，281，p1037-1044，(2001))。其它组织类型也包含这类细胞，但不能从人体中抽取相当大量的其它组织而不致发病。而吸脂术是塑身美体的一种常用方法，美国美容手术协会报告的2001年间吸脂术手术超过385000例。目前，标准的操作是将吸脂术得到的和其它方法取出的脂肪组织弃掉或销毁。脂肪组织干细胞和祖细胞群具有分化成多种细胞类型的能力(Zuk等，同前；Huang等，同前；Mizuno等，同前)。最重要的是，尽管其分化能力的最大特点是能够分化成中胚层来源的细胞系，然而有证据表明它们能够分化成内胚层和外胚层来源的细胞系。由于人体所有的细胞都来源于中胚层、内胚层或外胚层，这些资料提示脂肪组织干细胞和祖细胞，具有发育为人体任何细胞的能力，因而具有强大的治疗潜能(WO00/53795，2000年9月14日公开)。比如，骨、软骨、肌肉和脂肪起源于中胚层，神经和皮肤细胞起源于外胚层，多种组织如胰腺和内脏都可以用内胚层细胞治疗。除这种潜在的分化全能性外，所述细胞有相当大的增殖能力，体外培养能够繁殖许多代(循环)。在组织工程和基因药物应用方面，这两种相互关联的能力(分化和增殖)赋予脂肪组织干细胞和祖细胞重要的价值。然而，干细胞的应用不止是组织工程。因此干细胞的增殖和分化能力可用于基因转移和基因治疗，其中干细胞的子细胞可作为基因/基因产物的呈递载体。细胞低温保存在冷冻单个细胞、细胞沉淀或细胞悬液时，细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从脂肪组织中回收和保存干细胞、祖细胞以及基质用于治疗的方法，包括：ａ．真空吸取脂肪组织至容器的细胞收集部分，该部分由可渗透的膜将其与围绕细胞分离部分的容器分隔开，其中可渗透的膜将脂肪组织中的目的组分保留在细胞收集部分中，并将可丢 弃的组分透过该膜而除去；ｂ．分离收集部分中保留的物质，洗涤所述分离的物质以除去任何可丢弃的组分，并从中分离基质和无脂肪细胞的细胞群；ｃ．低温保存和存储无脂肪细胞的细胞群中的一种或多种目的组分与细胞基质。

【技术特征摘要】
US 2001-9-14 60/322,070;US 2002-9-12 10/242,0941.一种从脂肪组织中回收和保存干细胞、祖细胞以及基质用于治疗的方法，包括a.真空吸取脂肪组织至容器的细胞收集部分，该部分由可渗透的膜将其与围绕细胞分离部分的容器分隔开，其中可渗透的膜将脂肪组织中的目的组分保留在细胞收集部分中，并将可丢弃的组分透过该膜而除去；b.分离收集部分中保留的物质，洗涤所述分离的物质以除去任何可丢弃的组分，并从中分离基质和无脂肪细胞的细胞群；c.低温保存和存储无脂肪细胞的细胞群中的一种或多种目的组分与细胞基质。2.权利要求1中的方法，其中目的组分包括细胞群和基质，所述细胞群包括干细胞、祖细胞，可丢弃的组分包含肿胀溶液、盐水、血液、血栓、游离脂类和成熟的脂肪细胞。3.权利要求1中的方法，其中可渗透的膜是一种具有确定孔隙度的滤膜材料。4.权利要求1中的方法，其中分离和洗涤方法包括分离留在收集部分中的物质，分解所述分离的物质并将分解的物质置于等渗缓冲溶液中，由此从游离的脂类和脂肪细胞中分离出干细胞和祖细胞，并除去游离的脂类和脂肪细胞。5.权利要求4的方法，其中分解是通过将收集部分中的物质暴露于蛋白水解酶中、机械分解或是这些方法联用而完成的。6.权利要求5的方法，其中分解是通过将收集部分中的物质暴露于胶原酶、胰酶、木瓜蛋白酶、DNase或脂酶中，或者绞碎或剪切，或者这些方法联用而完成的。7.权利要求5的方法，其中从可丢弃的组分中分离干细胞和祖细胞的方法是离心或浮力密度浮选。8.权利要求1的方法，其中无脂肪细胞的细胞群，可以通过离心，纺丝膜分离、差异粘附、洗脱至固相结构、荧光激活细胞筛选或这些方法的联用而从其他物质浓缩。9.权利要求8的方法，其中固相结构是抗体包被的珠子。10.权利要求8中的方法，进一步包括将无脂肪细胞的细胞群分成干细胞富集相或祖细胞富集相。11.适于输给同种哺乳动物的治疗用的哺乳动物细胞，包括从脂肪组织分离的干细胞，所述干细胞在用前被低温保存和解冻。12.权利要求1的方法，其中低温保存包括将无脂肪细胞的细胞群与一种或多种冷冻保护剂混合，以恒定的约-1℃至-3℃的降温速率将混合物冷却，直至混合物降至-50℃，将冷却的混合物储存在含液氮的容器中。13.权利要求12的方法，其中冷冻保护剂选自渗透性、非渗透性冷冻保护剂以及它们的组合。14.权利要求13的方法，其中渗透性冷冻保护剂是二甲基亚砜、甘油、1，2丙二醇或它...

【专利技术属性】
技术研发人员：JK弗拉泽尔，MH赫德里克，
申请(专利权)人：马克罗珀尔生物外科公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]