本发明专利技术公开了半巢式-RT-Realtime?PCR检测马铃薯X病毒的试剂盒，包括TaqMan探针与引物的设计、植物总RNA提取及质量控制、将RNA反转录合成cDNA和实时荧光PCR检测。本方法有机地结合了实时荧光PCR和巢式PCR技术：在实时荧光PCR引物的外侧按照巢式PCR的设计原理增设了一条正链引物，反链引物分别与两条正链引物配对形成两套独立的PCR反应，并共用一条TaqMan探针。本发明专利技术的优点在于：引物极高的扩增效率保证了检测的高灵敏度，有效提高了检测的灵敏度，三条引物形成的两套PCR体系进行相互验证，极大地提高了检测的准确性，简化了操作并缩短了检测周期，全封闭的操作系统减少了污染。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种病毒的检测方法，具体地说是半巢式-RT-Realtime PCR检测马铃 薯X病毒的试剂盒，属于植物病毒检测领域。
技术介绍
马铃薯X病毒(Potato virus X，PVX)是马铃薯上最为重要的病害之一，严重感 病的马铃薯能减产80%以上。马铃薯X病毒粒子为弯曲状，长470-580nm，直径13nm，螺旋 对称结构，为单链RNA病毒。马铃薯X病毒通常具有中等致病性，引起许多单子叶植物和双 子叶植物的系统花叶和环斑症状。在自然条件通过机械接触传播，无已知介体，该病毒容易 通过人工接种传播。单一病毒的寄主范围较窄，马铃薯X病毒仅限于浸染茄科植物。虽然 是马铃薯X病毒单一浸染时症状比较轻微或在温度过高、过低或高肥水条件下极易隐症， 但是当该病毒与其它能协生的病毒复合感染抗耐病差的马铃薯品种时，常导致严重减产现 象，甚至达80%以上。因此，马铃薯X病毒是造成马铃薯病毒性退化的主要病毒之一。目前，检测马铃薯X病毒的方法主要有鉴别寄主接种法、酶联免疫吸附测定 (ELISA)、RT-PCR技术等。电镜技术设备昂贵，检测灵敏度低；ELISA技术操作步骤繁琐、检 测周期长、灵敏度低、易出现假阳性；PCR凝胶电泳技术较ELISA在多个方面有所提高，但易 于造成污染；未见采用实时荧光PCR检测PVX的研究所道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于，针对上述问题，提出根据PVX外壳蛋白(CP)基因的保守序列， 设计并合成了三条巢式PCR弓I物和一条TaqMan荧光探针，建立了半巢式-RT-Realtime PCR 检测PVX的新方法。该方法有机了结合了实时荧光PCR和巢式PCR技术在实时荧光PCR 引物的外侧按照巢式PCR的设计原理增设了一条正链引物；反链引物分别与两条正链引物 配对形成两套独立的PCR反应，并共用一条TaqMan探针。实时荧光PCR技术采用TaqMan 荧光探针信号放大的功能有效提高了检测的灵敏度；三条引物形成的两套PCR体系进行相 互验证，极大地提高了检测的准确性；全封闭的操作系统减少了污染，PCR结果的实时观察 极大缩短了检测周期。该方法检测的准确性、灵敏度等比巢式PCR、Real-time PCR及其它 方法高。本专利技术的技术方案为半巢式-RT-Realtime PCR检测马铃薯X病毒的试剂盒，包括以下步骤制备而成(I)TaqMAN探针与引物的设计合成，根据核酸数据库中PVX全基因组中CP基因序 列保守区，设计三条引物和一条TaqMan探针；(2)总RNA提取及质量控制，从植物叶片中提取总RNA，测定其OD值；(3)反转录合成cDNA，将提取的植物总RNA进行反转录合成cDNA ；(4)实时荧光PCR检测，包括特异性检测和灵敏度检测；所述的特异性检测方法为从感染PVX病毒及其它的对照植物叶片中提取总RNA，将提取的植物总RNA分别进行反转录合成特异性模板cDNA，将合成的cDNA进行引物探针特 异实时荧光PCR试验；所述的灵敏度检测方法为将上述步骤O)中提取的感染马铃薯X病毒的植物叶 片总RNA梯度稀释，并分别进行反转录合成cDNA，然后进行实时荧光PCR检验。所述的三条引物和一条TaqMan探针序列分别为一条上游引物序列为 5，-TGCCCAAACTGCTGCCTT-3，；另一条上游引物序列为5，-GGCCAGGGCACAATCCA-3，；下游引 物序列为5，-CAGTGATACGACCTCGAGTGACA-3，；探针序列为5，(FAM)-CGACTTTGCCAGCCTAGA TGCAG-3， (TAMRA)。所述的反转录合成cDNA的方法为在反应体系中加入缓冲液、反转录酶及其缓冲 液、随机引物、和植物总RNA，加焦碳酸二乙酯水定容，反应条件为37°C、15分钟，85°C、5 秒，合成cDNA。所述的缓冲液为5 PrimeScript Buffer,缓冲液中含有四种dNTP混合物和Mg2+ ； 所述的反转录酶及其缓冲液为I^rimeScript RT Enzyme Mix I，所述的随机引物为Oligo dT Primer 禾口 Random 6 mers。所述的特异性检测，反应体系为分别加入PCR SuperMix-UDG、荧光染料、上游 引物、下游引物、探针和cDNA，补充DEPC水定容；循环条件依次为45-55 V、l-3min ； 90-100°C、l-3min ；90_100°C、10_20s ；55_65°C、25_35s。所述的PCR SuperMix-UDG 为 2XPlatinum 定量 PCR SuperMix-UDG，主要包括 Platinun^iTaq DNA 聚合酶、Tris-HCl、KCl、6mM MgC12、400yM dGTP、400yM dATP、400yM dCTP、800 μ M dUTP、尿嘧啶DNA转葡糖基酶以及稳定剂。所述的循环条件最佳依次为:50°C、2分钟；95°C、2分钟；95°C、15秒，60°C、30秒， 45个循环。本专利技术的有益效果为本专利技术有机了结合了实时荧光PCR和巢式PCR技术在实 时荧光PCR引物的外侧按照巢式PCR的设计原理增设了一条正链引物；反链引物分别与两 条正链引物配对形成两套独立的PCR反应，并共用一条TaqMan探针。本专利技术中设计的三条 引物极高的扩增效率保证了检测的高灵敏度，同时采用实时荧光PCR技术中TaqMan荧光 探针信号放大功能也有效提高了检测的灵敏度；三条引物形成的两套PCR体系进行相互验 证，极大地提高了检测的准确性；能实时观察PCR的扩增过程和结果，无需进行后续大量而 繁琐的工作，简化了操作并缩短了检测周期；全封闭的操作系统减少了污染。与已报道的其 它方法相比较，该方法更简便、快速、准确和灵敏。试验结果表明，本专利技术方法的检测灵敏度 可达0. 071fg/ μ 1植物总RNA。附图说明图1为套1 (PVXF1/PVXR/PVXP)引物探针特异性试验PCR扩增结果； 图2为套2 (PVXF2/PVXR/PVXP)引物探针特异性试验PCR扩增结果；图3为套1 (PVXF1/PVXR/PVXP)引物探针灵敏度试验PCR扩增结果；图4为套2 (PVXF1/PVXR/PVXP)引物探针灵敏度试验PCR扩增结果；图 5 为套 1 组合(PVXF1/PV)(R/PVXP)和套 2 组合(PVXF2/PV)(R/PVXP)引物探针扩 增效率对比结果；图1中纵轴为Afo1(荧光信息增加值，下同)，横轴为Cycle number(循环数，下 同)；A 为 PVX，B、C、D、E、F 依次为为 ArMV、PVYn、PBRSV、健康叶(CKl)和 DEPC 水对照(CK2)；图 2 中纵轴为 Δ Rn,横轴为 Cycle number ；A 为 PVX, B、C、D、Ε、F 依次为为 ArMV、 PVYn、PBRSV、健康叶(CKl)和 DEPC 水对照(CK2)；图3 中纵轴为 ΔΙ η，横轴为 Cycle number ；A、B、C、D、Ε、F、G、H、I、J、K 所对应 的 RNA 浓度依次为 7. lng/μ l、710pg/y l、71pg/y 1、7. lpg/μ l、710fg/μ l、71f本文档来自技高网...
【技术保护点】
半巢式－ＲＴ－Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ检测马铃薯Ｘ病毒的试剂盒，其特征在于包括以下步骤制备而成：根据马铃薯Ｘ病毒全基因组中外壳蛋白基因序列保守区，设计三条引物和一条ＴａｑＭａｎ探针；（１）从植物叶片中提取总ＲＮＡ并测定其ＯＤ值；（２）将提取的植物总ＲＮＡ反转录合成ｃＤＮＡ；（３）实时荧光ＰＣＲ检测，包括引物探针的特异性检测和灵敏度检测。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：粟智平，李明福，耿金培，杨益娥，张京萱，栾晶，
申请(专利权)人：烟台出入境检验检疫局检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：37
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