本发明专利技术提供了一种分离纯化极端嗜酸热古菌的固体培养基及其配制方法。固体培养基成分为：果冻粉、硫氰酸钾、硫酸亚铁、酵母粉、9K基础培养基。配制方法为(1L)：A液：400～550ml蒸馏水，调pH＝1.8～2.5，加入果冻粉2～3g；B液：9K基础培养基150～300ml，调pH＝1.8～2.5，添加硫氰酸钾5～11g，酵母粉母液(0.2g/L)5～9ml；C液：50～100mL?9K基础培养基，加入硫酸亚铁9～15g，调节pH＝1.8～2.5，采用滤膜过滤除菌；将A、B液分别高温灭菌，冷却5～10分钟，分别纱布过滤后，与C液混合均匀，加蒸馏水至1L。基于该培养基可采用平板法分离和纯化极端嗜酸热古菌。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉 及一种极端嗜酸热古菌分离纯化固体培养基及其配制方法。
技术介绍
极端嗜酸热古菌是目前生物地球化学研究的热点之一，它能在高温、强酸/强碱条件、高盐、缺氧等极端环境下存在，其数量巨大，在全球的生物地球化学作用中扮演着重要角色。极端嗜酸热古菌是微生物进化的一个独立分支，由于其较强的铁、硫氧化活性，极端嗜热、嗜酸性，被作为生物冶金机制、古菌遗传机制及嗜热性研究的模式生物。极端嗜酸热古菌大多存在于含硫的酸性温泉中，能氧化亚铁和硫，在60-70°C下，促使氧化剂三价铁的再生，从而加速硫化矿中金属的溶出。大大缩短了浸矿周期，提高了浸矿效率，而被作为矿产资源综合利用和环境保护最有价值的微生物。但是，由于极端嗜酸热古菌的生存条件苛刻，认识相对局限，培养条件很难与自然条件一致，限制了纯培养物的大量获得，种质资源十分有限，并且大多为高温嗜盐古菌，其它种类的纯培养物尤为珍稀。如果能够得到较多的纯培养物，就能够为嗜热古菌的研究提供依据，揭开古菌研究的新篇章。该领域的研究对阐明生命运动的基本规律，揭示生命起源和物种进化，生物圈与地圈环境的相互作用，环境的生物治理，具有重要的意义。目前，极端嗜酸热古菌纯培养物的获得仍然是限制其相关研究及应用的“瓶颈”之一。近些年来，随着分子生物学技术和其他相关技术在微生物分离检测中的应用，越来越多的极端微生物被检测到，并且随着研究的深入和技术的进步，许多微生物从不可培养状态达到了可培养状态，对新分离纯的极端菌的性质的研究也取得了许多新进展。极端微生物分离纯化方法概括起来可分为以下三种1)模拟自然环境分离得到纯培养。2)利用荧光探针标记已探知的基因，跟踪分离得到纯培养。3)通过极端微生物营养状态研究，实现微生物分离纯化。例如Kaeberlein等 (2002年)利用选择性膜技术和固定化技术，通过限制营养得到不可培养微生物纯培养，其研究方法和思路发表于2002年科学杂志上。Rapp6等 (2002年)利用DNA杂交技术从海洋中分离得到大量不可培养微生物纯培养，其中SARll 菌株被确认为目前发现的最小细菌，其研究思路与方法发表在2002年自然杂志上。这些技术推动了极端微生物研究的进步，但是由于其要求苛刻，操作繁琐，很难在实验室推广。因此，大多数研究者依然采用固体培养基分离纯化极端微生物，固体培养基分离纯化是细菌分离纯化的一种常用手段，它是利用细菌先分离、后克隆的原则，形成一个肉眼可见的单菌落进行分离的。常规固体培养基利用琼脂作为凝固剂，琼脂由于形成凝胶后透明度高、保水性好、无毒、不被微生物液化等优点，而被广泛的使用。但是，对极端嗜酸热古菌，利用常规琼脂固体平板分离方法很难获得纯培养物。其原因是过低的PH会造成培养基的胨化，以及琼脂的熔点难以满足高温的要求。近些年来，人们发现无机硅胶、瓜尔胶、卡拉胶黄原胶、刺槐豆角、聚丙烯酸系高分子化合物在某些情况下可以替代琼脂用作凝固剂。可是，这些凝固剂在使用过程中存在的许多弊端，也难以实现极端嗜酸热古菌的分离纯化。因此，寻找一种来源广泛、廉价、优良的替代品是必须的。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种适合极端嗜酸热古菌分离纯化的固体培养基及其配制方法。本专利技术的目的是通过以下方式实现的一种分离纯化极端嗜酸热古菌的固体培养基，配制IL所述培养基的配方包括硫氰酸钾5 llg、硫酸亚铁9 15g、0. 2g/L的酵母粉母液5 9ml、9K基础培养基200 400ml、果冻粉2 3g ；余量为蒸馏水。一种分离纯化极端嗜酸热古菌的固体培养基的配制方法，包括以下步骤A液400 550ml蒸馏水，调pH = 2. 5 3，加入果冻粉2 3g ；B液9K基础培养基150 300ml，调pH = 1. 8 2. 5，添加硫氰酸钾5 llg， 0. 2g/L的酵母粉母液5 9ml ；C液9K基础培养基50 IOOmL,加入硫酸亚铁9 15g，调节pH = 1. 8 2. 5， 采用滤膜过滤除菌；将A、B液分别高温灭菌，冷却5 10分钟，纱布过滤后，与C液混合均勻，加蒸馏水至IL ；倒制平板。所述的C液采用0. 22 μ m滤膜过滤除菌。与C液混合前将A、B液在121°C灭菌 10 30分钟。本专利技术在对实验室保藏的几株极端嗜酸热古菌生存环境及条件了解的基础上，抓住限制其生长的主要因素，采用一种新型耐高温、耐酸凝固剂，合成一种分离纯化固体培养基，并结合水盘培养法，成功分离纯化了极端嗜酸热古菌万座酸菌(Acidianus manzaensis)和金属硫化叶菌(Sulfolobus metallicus)。该培养基在极端嗜热/嗜酸，中度嗜热/嗜酸及嗜热/嗜酸菌的分离纯化、改良等方面具有广阔的应用前景。采用本专利技术的培养基并结合水盘培养法，对中南大学教育部生物冶金重点实验室保藏的极端嗜酸热古菌万座酸菌(Acidianus manzaensis)和金属硫化叶菌(Sulfolobus metallicus)进行了检验。结果表明，万座酸菌、金属硫化叶菌能够在合成培养基上形成 Imm大小的黄褐色菌落(见图1)，培养基能够应用于极端嗜酸热古菌的分离纯化等领域。该固体培养基与传统固体培养基相比还具有以下两大优点果冻粉作为凝固剂，其来源广泛且价格低廉(30元/公斤)，传统琼脂粉凝固剂 (80 元 /500g)。作为凝固剂的果冻粉耐受高温(彡95°C )、高酸(彡1. 8)，是极端嗜酸热古菌生长的良好媒介。附图说明图1为本专利技术培养基分离纯化的万座酸菌、金属硫化叶菌的照片。其中左图为 Acidianus manzaensis ；右图为 Sulfolobus metallicus。具体实施例方式下面结合实施案例对本专利技术作进一步说明，而非限制本专利技术。实施例11.培养基的合成A液550ml蒸馏水，调pH = 2. 5，加入果冻粉2g。果冻粉购自湖南长沙日成晟食品添加剂厂，产品型号为ZG-30B。B液9K基础培养基300ml，调pH = 1. 8，加入硫氰酸钾5. 83g，酵母粉母液(0. 2g/ L)9ml。C液9K基础培养基80mL，加入硫酸亚铁9. 17g，调节pH = 1. 8，采用0. 22 μ m滤膜过滤除菌。B液于121°C分别灭菌10分种，冷却5分钟，纱布过滤后，与C液混合均勻，加蒸馏水至IL ；倒制平板(9cm)，每板大约20ml。2.细菌活化分别取出冷冻保藏的菌种万座酸菌(Acidianus manzaensis)、金属硫化叶菌 (Sulfolobusmetallicus)(由中南大学生物冶金课题组采用传统无限稀释分离纯化方法获得，并鉴定，现保藏于中南大学生物冶金教育部重点实验室)，分别利用9K基础培养基，并利用硫酸亚铁作为能源，进行活化，待接种菌株进入对数生长期后，分别吸取Iml，进行十倍梯度稀释，分别吸取稀释了 10倍和100倍的稀释液各1ml，置于固体培养基中央，涂布平板。3.细菌培养将接种的固体培养平皿放于自制水盘内(医用手术盘，用脱脂棉铺4cm厚，注入大约500ml蒸馏水，定期补足水分)。置于隔水式恒温培养箱(上海一恒-9050)中65°C培养， 直至长出肉眼可见的菌落。4.单菌落分离、纯化与鉴定大约4天左右，固体培养基上会长出单菌落(见图1)，分别挑取单菌落，重复上本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种分离纯化极端嗜酸热古菌的固体培养基，其特征在于，配制１Ｌ所述培养基的配方包括：硫氰酸钾５～１１ｇ、硫酸亚铁９～１５ｇ、０．２ｇ／Ｌ的酵母粉母液５～９ｍｌ、９Ｋ基础培养基２００～４００ｍｌ、果冻粉２～３ｇ；余量为蒸馏水。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：夏金兰，邱冠周，巩三强，潘佳民，聂珍媛，梁长利，张瑞永，
申请(专利权)人：中南大学，
类型：发明
国别省市：43
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