本发明专利技术公开了一种含有转基因位点的番茄株的制备方法，其步骤：A、T0代含有转基因位点的番茄转化苗的制备；B、T0代番茄转化苗中筛选出稳定表达的个体：a)T0代转化苗进行PCR筛选；b)T0代转化苗进行杂交检测其中外源基因的拷贝数；c)T0-11转化苗进行GUS染色；C、T0-11株系与未转化的番茄进行杂交获得F1代：将未转化的番茄的花粉收集涂抹在T0-11株系的雌蕊上，获得了F1代的种子；D、F1代个体的遗传稳定性鉴定：a)PCR初步筛选分离出不含有转基因位点的个体；b)含有转基因位点的F1代个体T-DNA完整性；c)F1代个体中T-DNA的遗传稳定性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程中的植物转化
，更具体涉及一种含有特定的转基因位点的番茄株系的制备方法。
技术介绍
定点重组技术是在转基因研究中基于定点重组系统而开发出来的一种从基因组中删除序列或者将外源基因整合到基因组的特异性位点中去的新型技术。定点重组的基本原理分基因删除和基因整合两个方面来描述。共同点是它们都包括重组酶和一段能被该酶识别的DNA序列。对于基因删除，是在同一个DNA分子中含有两个同向的重复序列，这段序列可以被特异的重组酶识别，从而在这两段重组酶识别位点处发生DNA的融合交换，将这两段序列间的基因删除出去。对于基因整合，是在两个DNA分子中各含有一个重组酶识别位点，当重组酶介入时，这两段序列互相识别而将外源的基因带入到基因组中去。基因叠加技术则是基因整合的延伸，在外源DNA分子上除了含有与内源重组酶识别位点同源的序列之外，还含有一个新的重组酶识别位点，以便下一个基因整合时再次被识别，这样外源基因就可以逐一定点叠加到靶基因组中。基因叠加的示意图如图1所示(0w，2005)。植物中已被应用的定点重组系统有3种大肠杆菌噬菌体Pl的Cre/lox重组系统(Sauerand Henderson 1988)、酿酒酵母 2 μ m 质粒的 FLP/frt 重组系统(Golic and Lindquist 1989)和接合糖酵母的pSRl质粒的R/Rs重组系统(Onouchi et al. 1991)。除了以上3种重组系统之外，还有两种不可逆的重组系统，一种是β-six和γ δ-res重组系统，该重组系统具有相同的重组酶识别位点，但是只能催化DNA片段的删除，而不能催化 DNA 的整合。另一种是 phiC31，TP901-l，λ，Bxbl 等重组系统(Thomson and Ow 2006)，该重组系统最大的特点是识别两个不同的重组位点(attB和attP)，重组反应发生后由于碱基交换产生两个与原来不同的位点attL及attR ；而重组酶不能继续催化新生成的位点间的反向重组反应。利用随机插入和整合的转基因技术，筛选优良株系是非常烦琐的过程，而且费时费力，转基因技术的新突破在于通过高效定点重组反应介导外源基因在特定位点的逐一导入，并且能进行稳定表达和遗传，为多基因复合性状的转基因技术提供了理论依据。定点重组反应在特异性位点整合进目的基因的同时，在目的基因后端保留一个重组酶的识别位点，而基因叠加技术则利用该识别位点，将含有相应识别位点的第二个外源基因整合进去， 植物体中的重组酶识别位点和外源载体中的重组酶识别位点在重组酶的作用下发生交换重组，依此类推，就可以达到在特定位点进行基因叠加的效果。而且每发生一次重组的同时，选择标记基因也被删除，因此进行第二次重组时，可以使用与前一次同样的选择标记基因，从而降低转基因技术中选择标记基因的负面影响。特定位点的基因叠加技术可以多次利用同一插入位点，将多个优良性状累加到一个优良品种中，减少外源基因结构的不确定性，并保证外源基因的稳定表达，降低外源基因对基因组中其他基因的影响。同时，大大缩短了新品种的育种年限，加快转基因作物的研发进程。另外，特定位点的基因叠加技术是研究基因家族和同一代谢途径中多个基因功能的优良平台。通过将多个基因整合到同一插入位点，可以系统地比较每个基因的功能，并有效地研究基因间的拮抗和协同作用。
技术实现思路
本专利技术的目的是在于提供了一种含有特定转基因位点的番茄株的制备方法，实验所用的番茄品系编号为HW0160(由北京蔬菜研究中心柴敏老师赠送)，无限花序，粉色大果。该株系中含有一系列可以被定点重组酶识别的位点，这些位点可用于后续基因的逐步叠加，使多个基因逐步叠加到靶基因株系中的同一个位点上并稳定表达。将含有重组酶识别位点的载体PYWP72，在农杆菌介导下侵染番茄子叶，获得转基因苗，再通过与野生型杂交，获得只含有一个转基因位点的番茄靶基因株系。为了实现上述的目的，本专利技术采用以下技术措施一种含有特定转基因位点的番茄株的制备方法，其步骤是1、Ttl代含有特定转基因位点的番茄转化苗的制备通过农杆菌介导的子叶侵染法，将载体pYWP72(Yau et al. ,2011)转化到番茄HW0160株系中，获得可能含有特定转基因位点的Ttl代番茄转化苗33株。载体PYWP72的主要特点是(图2所示)(1)含有整合重组酶所识别的int位点， 可以与外源基因的另一个同源的int位点识别，并将外源基因整合到基因组中；( 含有删除重组酶所识别的res位点，位于T-DNA的左右边界附近，可以在特定的组织或器官中完全删除外源基因，从而控制转基因的基因流；(3)在nptll选择基因的两侧有一对同向的IoxP 位点，可以在转化完成之后删除掉选择基因，为下一轮整合发生时使用同样的选择基因提供了便利；C3)在gus基因一侧含有一个反向的IoxP位点，用于在下一轮整合时删除掉多余的拷贝数，只留下一个拷贝的外源基因整合进基因组中。2、Ttl代番茄转化苗中筛选出稳定表达的个体a) T0代转化苗进行PCR初步筛选提取33株Ttl代转化苗的基因组DNA，进行PCR 检测，引物从上游35S启动子和下游nptll基因内部设计，鉴定是否为真正的转基因苗，通过扩增的结果得出13株Ttl代转化苗可能含有nptll抗性基因，表型与未转化的株系无明显差异。所述的引物为35Sd-F:5' -CCCAAGCTTCCCAGATTAGCCTTTTCAATTTC-3‘；nptll-R 5' -TCGATCCGAACCCCAGAGTC-3‘；(由英骏公司合成)b)Ttl代转化苗进行Southern杂交(Sambrook et al. 1989)检测其中外源基因的拷贝数13株Ttl代转化苗的基因组DNA进行酶切，限制性内切酶为^(bal，探针是由gus基因内部设计引物合成，结果有1株为含有单拷贝外源基因的转化株，命名为Ttl-Il (图3所示)°所述的探针为gus探针，合成引物为gus-F 5' -CGTTTCGATGCGGTCACTCATTACG-3‘；gus-R 5' -TCTCCTGCCAGGCCAGAAGTTCTT-3‘；(由英骏公司合成)c) Ttl-Il转化苗进行⑶S染色=Ttl-Il的幼嫩叶片经⑶S染色液染色，然后在酒精中脱色，去掉叶绿素的干扰背景后，叶片的叶脉呈蓝色(图4所示)。3、T0-Il株系与未转化的番茄进行杂交获得F1代=Ttl-Il株系的花朵去雄，将未转化的番茄的花粉收集涂抹在Ttl-Il株系的雌蕊上，该组杂交获得了 10粒F1代的种子。4、F1代个体的遗传稳定性鉴定a)PCR初步筛选分离出不含有转基因位点的个体由于Ttl-Il株系不是纯合体，在 F1代中会发生分离，同样用筛选Ttl代转化苗的引物对检测F1代个体中是否含有nptll基因，将不含有该基因的个体剔除出去。结果有6株F1代个体中依然检测到nptll基因，株系表型如图5A、B、C、D、E、F所示。b)含有转基因位点的F1代个体的T-DNA完整性在T-DNA插入的左边界和右边界处分别设计引物对P1+P2和P3+P4(引物的位置如图2所示)，通过PCR扩增鉴定T-DNA的完整性，6株含有nptll基因的F1代个体的插入位点是完整的，并没有发本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种含有转基因位点的番茄株的制备方法，其步骤是：Ａ、Ｔ０代含有特定转基因位点的番茄转化苗的制备：通过农杆菌介导的子叶侵染法，将载体ｐＹＷＰ７２转化到番茄ＨＷ０１６０株系中，获得含有转基因位点的Ｔ０代番茄转化苗；Ｔ０代番茄转化苗中筛选出稳定表达的个体： ａ ） Ｔ０代转化苗进行ＰＣＲ筛选：提取Ｔ０代转化苗的基因组ＤＮＡ，进行ＰＣＲ检测，引物从上游３５Ｓ启动子和下游ｎｐｔＩＩ基因内部设计，鉴定为转基因苗，通过扩增的结果得出Ｔ０代转化苗含有ｎｐｔＩＩ抗性基因，表型与未转化的切酶酶切之后，杂交ｎｐｔＩＩ探针，得到大小为２２７５ ｂｐ的片段；经ＢａｍＨＩ限制性内切酶酶切之后，杂交ｇｕｓ探针，得到大小为６０７７ ｂｐ的片段，与载体ｐＹＷＰ７２的结构吻合，６株Ｆ１代个体在遗传到后代中没有发生基因的丢失或重排。ＮＡ的完整性，６株含有ｎｐｔＩＩ基因的Ｆ１代个体的插入位点是完整的，没有发生丢失；ｃ ） Ｆ１代个体中Ｔ－ＤＮＡ的遗传稳定性：在ｇｕｓ基因和ｎｐｔＩＩ基因内分别设计引物合成探针，６株Ｆ１代个体的基因组ＤＮＡ作为模板，经ＨｉｎｄＩＩＩ限制性内ｔＩＩ基因，将不含有该基因的个体剔除出去，结果有６株Ｆ１代个体中依然检测到ｎｐｔＩＩ基因；ｂ ） 含有转基因位点的Ｆ１代个体的Ｔ－ＤＮＡ完整性：在Ｔ－ＤＮＡ插入的左边界和右边界处分别设计引物对Ｐ１＋Ｐ２和Ｐ３＋Ｐ４，通过ＰＣＲ扩增鉴定Ｔ－Ｄ在Ｔ０－１１株系的雌蕊上，该组杂交获得了１０粒Ｆ１代的种子；Ｆ１代个体的遗传稳定性鉴定：ａ ） ＰＣＲ初步筛选分离出不含有转基因位点的个体：Ｔ０－１１株系不是纯合体，在Ｆ１代中发生分离，同样用筛选Ｔ０代转化苗的引物对检测Ｆ１代个体中含有ｎｐ） Ｔ０－１１转化苗进行ＧＵＳ染色：Ｔ０－１１的幼嫩叶片经ＧＵＳ染色液染色，然后在酒精中脱色，去掉叶绿素的干扰背景后，叶片的叶脉呈蓝色；Ｔ０－１１株系与未转化的番茄进行杂交获得Ｆ１代：Ｔ０－１１株系的花朵去雄，将未转化的番茄的花粉收集涂抹株系无差异；ｂ ） Ｔ０代转化苗进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交检测其中外源基因的拷贝数：１３株Ｔ０代转化苗的基因组ＤＮＡ进行酶切，限制性内切酶为ＸｂａＩ，探针是由ｇｕｓ基因内部设计引物合成，有１株为含有单拷贝外源基因的转化株，命名为Ｔ０－１１；ｃ...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王瑛，周银，
申请(专利权)人：中国科学院武汉植物园，
类型：发明
国别省市：83
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