本发明专利技术涉及马铃薯致病疫霉Δ6去饱和酶基因PinD6的克隆及其应用，属于分子生物学和生物技术领域。通过RT-PCR的方法，在马铃薯致病疫霉中克隆到一个去饱和酶基因的cDNA片段。经过酵母表达鉴定，确定它是一个新的Δ6去饱和酶基因，其编码的Δ6去饱和酶能够将亚油酸和亚麻酸分别转化成γ-亚麻酸和十八碳四烯酸，可以用于植物特别是油料作物中生产鱼油。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及在马铃薯致病疫霉(Phytophthora infestans)超长链多不饱和脂肪酸合成代谢途径中Δ6去饱和酶基因PinD6的克隆、功能鉴定与应用，属于分子生物学和生物
技术介绍
超长链多不饱和脂肪酸，一般含20-22个碳、4-6个顺式双键，例如花生四烯酸 (ΑΑ,20:4Δ5'8'11'14)>ΕΡΑ(20:5Δ8'11'14'17)以及 DH/U226 Δ4’7a°’13’16’19)对人类营养和健康具有重要的作用。经常补食EPA和DHA这类脂肪酸不仅对胎、婴幼儿大脑皮层及神经元的发育具有重要作用(Crawford，2000)，而且能够降低心脑血管疾病、高血压以及炎症等疾病的发病率(Thies et al. ,2003 ；Kinsella et al. , 1990 ；Yamazaki et al.，1992)。目前，这类脂肪酸主要来源于深海鱼油。由于过度捕捞，导致海洋野生鱼资源日益枯竭，鱼油产量已经不能够满足人们正迅速增长的需要(Pauly et al.，2003)。此外，由于环境污染等，导致鱼油中重金属离子与有机氯等有毒物质的含量升高，严重影响鱼油的食用安全性(Yokoo et al. ,2003 ；Drexler et al.，2003)。因此，迫切需要一条持续、稳定、安全的鱼油替代生产途径。高等植物能够大量合成亚油酸(LA，18:2A9’12)和亚麻酸(ALA，183 Δ9’12’15)，但是不能够合成超长链多不饱和脂肪酸。一些真菌和微藻等能够将自身的LA和ALA通过“ Δ 6 去饱和途径”中的一系列链延长酶和去饱和酶催化作用转化生成EPA和DHA。LA和ALA 在Δ 6去饱和酶的催化作用下，生成Y-亚麻酸(GLA，18:3A6’9’12)和十八碳四烯酸(SDA， 18:4Δ6’9’ 2’ 5)，然后再在Δ 6链延长酶催化作用下生成二高-Y-亚麻酸(DGLAJOJA8’11’ 14)和二十碳四烯酸(ΕΤΑ，20:4Δ8’"’14’17)。最后，在Δ5去饱和酶催化作用下生成AA和ΕΡΑ。 EPA经过一次Δ 5链延长和一次Δ 4去饱和生成DHA。通过代谢基因工程技术将海洋微藻或真菌中的超长链多不饱和脂肪酸合成代谢途径移植到植物中，从而在植物特别是油料作物种子中生产此类脂肪酸，将是一条理想的鱼油替代生产途径。目前，此合成代谢途径中的相关基因已经陆续在高等植物、海藻、真菌、 线虫、苔藓以及动物等克隆到(Yadav et al.，1993 ；Wallis and Browse, 1999 ；Qi et al.， 2002 ；Michaelson et al.,1998 ；Sayanova et al. ,2006 ；Kajikawa et al. ,2006；Choet al.，1999 ；Sperling et al.，2000 ；Leonard et al.，2000 ；Watts and Browse, 1999)，并都已申请专利保护。尽快发掘克隆这类基因资源，获得具有自主知识产权的基因，为我国通过转基因技术在油料作物中生产此类保健脂肪酸奠定基础，是本项专利技术创造的重要目的。
技术实现思路
本专利技术首先提取马铃薯致病疫霉总RNA，反转录成cDNA后，用引物 5，-ATGGTGGACGGCCCCAAG-3，和 5，-TTACATGGCGGGAAACTC-3，做 PCR，将扩增的片段胶回收后，连接到克隆载体PMD18-T中。生物信息学分析，得到的cDNA片段开放阅读框部分为1371bp，编码456个氨基酸的多肽，具备“front-end”去饱和酶所具有的N端细胞色素沾结构域(HPGG)，以及和电子传递有关的三个组氨酸框结构域(HxxxH、Hxxffi^nLNxQxxHHLFP)。 该基因cDNA序列如下 序列表(I)SEQ ID NO. 1 的信息(a)序列特征 *长度1371碱基对 *类型核酸 *链型双链 *拓扑结构线性(b)分子类型cDNA(c)假设否(d)反义否(e)最初来源马铃薯致病疫霉(Phytophthorainfestans)(f)序列描述=SEQ IN NO. 11 ATGGTGGACGGCCCCAAGACCAAGCGCAAGATCTCGTGGCAGGAGGTCAAGCAGCACGCG61 TCGTACGACAATGCGTGGATTGTCATCCACCACAAGGTCTACGACATCAGCAAATGGGAC121GCCCACCCGGGCGGCATGGTCATGCTCTCCCAGGCGGGTGAAGATGCCACGGATATCTTC181ACTGTGTGCCACCCGACGAGCTCCTGGAAGCAGCTAGAGCAGTTCTACATCGGCGACGTG241GATGAGAGCACGGCGACGGTCAACGAGGACCTCTCGGAGGAGGAGAAGGCTAAGAAAGCC301AAGACCGACGAGTTCATCAGCGCGTACCGTCGTCTACGTATCAAGATTAAGGGCATGGGC361CTCTATGACGCCAGTATGGTCTTCTACGCGTGGAAAATCCTCAGCACGTTCGGTCTCTGG421ATGGCTTCTGCTGCTATCTGCTGGCACTTTGACAGTTGGCCCATGTACATGCTCGCAGCG481TGTGTCATGGGTCTCTTCTGGCAGCAATCCGGCTGGCTGGCACACGACGTGCTGCACCAT541CAAGTGTGGGACAACCACATGATTGGCAACGTCATGGGCGTCATTATCGGTGACGTCTGG601ATGGGATTCAGTGTGCAGTGGTGGAAGAACAAGCACAACTTCCACCACGCCGTGCCCAAC661CTTATTGGGGACGAAAAAACAAAGTATTTGGGTGACCCGGACATCGATACCATGCCATTG721TTGGCTTGGAGCAAGCACATGGCGTCGAAAGCCTACGAGTCGAGCTGGGGTCCGTTCTTT781GTGGGCCACCAGGCTGTCATCTACTTTCCGTTGCTACTCTTCGCTCGCTTCAGCTGGCTG841TTGCAGAGTTACTACTACGTCTTCAAAGGCTTCGCGTTCGGTAAATACGACCCCGTGGAT901CTTCCGAATGGCGAGAAAGTCGGCCTCATGTTGCACTACATTTGGAACGTTATGTTGCCC961 GTTGTCACGG GCATGTCGGT GGCTCAGGGT CTGGCCTTCT TTATGCTCGC GCAAATGTCG 1021TGTGGCGGCT TCCTGGCTGC TGTCTTTAGT GTGGGCCACA ACGGTATGTC GGTGTATGAG 1081CGTGAAGACA AGCCCGACTT CTGGCAGTTG CAGGTCACCA CTACGCGCAA CATTACGCCG 1141GGCTTCTTCA TGGACTGGTT CTGTGGCGGT CTCAACTATC AG本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一个马铃薯致病疫霉Δ６去饱和酶基因ＰｉｎＤ６，其特征在于：其具有核苷酸序列如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１所示；该核苷酸序列编码氨基酸序列如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：亓宝秀，李新征，孙全喜，
申请(专利权)人：山东农业大学，
类型：发明
国别省市：37
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