本发明专利技术公开了检测豇豆胰蛋白酶抑制剂的方法及其专用酶联免疫试剂盒。本发明专利技术所提供的酶联免疫试剂盒含有豇豆胰蛋白酶抑制剂单克隆抗体；所述豇豆胰蛋白酶抑制剂单克隆抗体，是由保藏编号为CGMCC?No.4617的豇豆胰蛋白酶抑制剂单克隆抗体杂交瘤细胞株CpTI?3D6分泌产生的。本发明专利技术应用抗CpTI多克隆抗体及酶标记抗CpTI单克隆抗体，采用双抗夹心ELISA方法进行试剂盒制备，并应用制备的试剂盒鉴定转基因作物真伪，具有快速、灵敏的优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及检测豇豆胰蛋白酶抑制剂的方法及其专用酶联免疫试剂盒。
技术介绍
豇豆胰蛋白酶抑制剂(CpTI)属于丝氨酸蛋白酶抑制剂家族中的Bowman-Birk类型的双头蛋白酶抑制剂，即一个抑制剂分子可以抑剂两个胰蛋白酶分子的催化活性。自上世纪80年代，CpTI基因作为一种抗虫基因成为转基因植物的备选基因，并在表达后与非转基因植物相比表现出优良的抗虫特性，目前已成为我国众多转基因棉花品种中所携带的基因。准确评价CpTI转基因作物的生态和食品安全性、进行转基因产品的强制标识，检验和监测转基因作物种子的纯度等，必须建立起一套具有自主知识产权的快速、准确的外源基因表达蛋白的检测方法。目前检验CpTI转基因植物常用的方法是基因层面的分子检测方法。由于酶联免疫测定技术具有高通量、快速及灵敏度高等特点，在转基因植物鉴定等方面已经获得了广泛的应用，但CpTI的双抗夹心酶免疫检测方法还未见报道，所以建立一种精确的CpTI免疫检测方法具有非常重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种豇豆胰蛋白酶抑制剂单克隆抗体。本专利技术所提供的豇豆胰蛋白酶抑制剂单克隆抗体，是由保藏编号为CGMCC No. 4617的豇豆胰蛋白酶抑制剂单克隆抗体杂交瘤细胞株CpTI 3D6分泌产生的。本专利技术的另一个目的是提供保藏编号为CGMCC No. 4617的豇豆胰蛋白酶抑制剂单克隆抗体杂交瘤细胞株CpTI 3D6。所述豇豆胰蛋白酶抑制剂单克隆抗体在制备检测豇豆胰蛋白酶抑制剂的酶联免疫试剂盒中的应用也属于本专利技术的保护范围。本专利技术的又一个目的是提供一种检测豇豆胰蛋白酶抑制剂的酶联免疫试剂盒。本专利技术所提供的检测豇豆胰蛋白酶抑制剂的酶联免疫试剂盒，含有所述豇豆胰蛋白酶抑制剂单克隆抗体、豇豆胰蛋白酶抑制剂的多克隆抗体、豇豆胰蛋白酶抑制剂标准品； 所述豇豆胰蛋白酶抑制剂标准品为豇豆胰蛋白酶抑制剂。所述豇豆胰蛋白酶抑制剂标准品的浓度为100ng/mL、50ng/mL、25ng/mL、12. 5ng/ mL、6. 25ng/mL、3. lng/mL、l. 56ng/mL、0. 78ng/mL 禾口 0. 39ng/mL。所述豇豆胰蛋白酶抑制剂标准品按照包括如下步骤的方法制备得到的(1)将豇豆种子粉浸泡于质量百分比为0. 3%的氯化钠水溶液中，得到浸泡后的混合物；将所述浸泡后的混合物离心，取上清液，即得到提取液；将所述提取液用饱和硫酸铵溶液进行盐析粗纯化，取30% -60%盐溶度间的蛋白溶液，即得到粗纯化的豇豆胰蛋白酶抑制剂溶液；所述浸泡的温度为4°C和浸泡时间为16h ；所述粗纯化的温度为4°C和粗纯化时间为4h ；(2)将步骤⑴得到的粗纯化的豇豆胰蛋白酶抑制剂溶液在以下条件下进行凝胶过滤葡聚糖G-50填料，16mmxl00cm层析柱，0. IM pH7. OPBS缓冲液洗脱，流速0. 3ml/h, 1. 5mL/管进行分步收集，取活性高部分浓缩，得到浓缩液；(3)将步骤( 得到的浓缩液在以下条件下进行亲和层析CNBr-Sepher0Se4B 填料，以猪胰蛋白酶作为配基，上样缓冲液为0. IM pH7. OPBS缓冲液，洗脱液为0. 1ΜρΗ3. 0 甘氨酸-HCL缓冲液，流速lmL/min，每ImL进行分步收集，取浓度高收集液合并，0. IM PH7. OPBS缓冲液透析冻干，用体积比为1 1的水甘油混合液进行溶解，即豇豆胰蛋白酶抑制剂。所述试剂盒中含有用于标记所述豇豆胰蛋白酶抑制剂单克隆抗体的标记酶。所述试剂盒中包括包被缓冲液、洗涤液、底物缓冲液、终止缓冲液和封闭液；所述包被缓冲液由Na2C03、NaHCO3和水组成；以上各成分在包被缓冲液中的浓度分别为=Na2CO3O. OlM和NaHCO3O. 04M ；所述洗涤液由Nei2HPO4、KH2PO4、NaCl、吐温-20和水组成；以上各成分在洗涤液中的浓度分别为Νει2ΗΡ040. 02Μ、KH2PO4O. 0015Μ、NaClO. 14M 和吐温-20的体积百分比浓度为0. ；所述底物缓冲液由柠檬酸三钠、Na2HPO4和水组成；以上各成分在底物缓冲液中的浓度分别为柠檬酸三钠0. OlM和Na2HPO4O. 03M。所述终止缓冲液由硫酸和水组成；所述硫酸在所述终止缓冲液中的浓度为2M ；所述封闭液由Na2HPCV KH2PO4、NaCl、脱脂牛奶和水组成；以上各成分在封闭液中的浓度分别为Νει2ΗΡ040. 02Μ、KH2PO4O. 0015Μ、NaClO. 14M 和脱脂牛奶的质量百分比浓度为3%。所述标记酶为辣根过氧化物酶。本专利技术的又一个目的是提供一种检测豇豆胰蛋白酶抑制剂的方法。本专利技术所提供的检测豇豆胰蛋白酶抑制剂的方法，包括如下步骤将待测样品进行前处理，得到样品检测液；再用所述试剂盒对样品检测液进行检测；所述前处理的方法包括如下步骤将所述待测样品研磨后，用PBS缓冲液进行浸泡，得到浸泡后的混合物；将所述混合物进行离心，取上清，即得到样品检测液；所述浸泡的时间为12小时；所述离心的转速为8000r/min和离心的温度为4°C ；所述PBS缓冲液由Νει2ΗΡ04、KH2PO4, NaCl和水组成；以上各成分在PBS缓冲液中浓度分别为Νει2ΗΡ04 0 . 02Μ、KH2PO4 0. 0015Μ和NaCl 0. 14Μ。所述豇豆胰蛋白酶抑制剂单克隆抗体、所述试剂盒或所述方法在鉴别转CpTI基因植物中的应用也属于本专利技术的保护范围。本专利技术的又一个目的是提供一种辅助鉴别转CpTI基因植物的方法。本专利技术所提供的辅助鉴别转CpTI基因植物的方法，包括如下步骤用所述试剂盒对待测植物进行检测，以已知的非转基因植物作为对照，若对待测植物进行检测时检测孔的吸光值大于所述对照的3倍，则确认所述待测植物为候选的转CpTI基因植物。本专利技术应用抗CpTI多克隆抗体及酶标记抗CpTI单克隆抗体，采用双抗夹心ELISA 方法进行试剂盒制备，并应用制备的试剂盒鉴定转基因作物真伪，具有快速、灵敏的优点。本专利技术所提供的检测豇豆胰蛋白酶抑制剂的方法及其专用酶联免疫试剂盒将有广阔的应用前景。附图说明图1为酶联免疫试剂盒检测CpTI蛋白浓度的标准曲线。 具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、制备检测豇豆胰蛋白酶抑制剂的酶联免疫试剂盒一、试剂盒的制备 (一)CpTI免疫原和CpTI标准品的制备CpTI免疫原和CpTI标准品经由豇豆蛋白提取、盐析、凝胶过滤和亲和层析步骤获得，具体方法如下(I)CpTI蛋白提取和粗纯化以高盐溶液进行豇豆总蛋白提取，具体方法为取80克黑梅一号豇豆种子(购白益农蔬菜种子商行)研磨成粉用400ml 0. 3%氯化钠水溶液进行浸泡，浸泡条件为温度为 4°C，时间为16h，期间进行摇动，离心，取上清液，即得到提取液。将得到的提取液以饱和硫酸铵溶液进行盐析粗纯化，粗纯化条件为温度为4°C， 时间为4h，静置，取30% -60%盐溶度间的蛋白溶液，即得到粗纯化CpTI蛋白溶液。(2)凝胶过滤取步骤(1)所得粗纯化的CpTI蛋白溶液进行凝胶过滤，凝胶过滤的条件为葡聚糖 G-50填料，16mmxl00cm本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种豇豆胰蛋白酶抑制剂单克隆抗体，是由保藏编号为ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．４６１７的豇豆胰蛋白酶抑制剂单克隆抗体杂交瘤细胞株ＣｐＴＩ ３Ｄ６分泌产生的。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王保民，谭桂玉，南铁贵，赵洪伟，高巍，王敏，孙硕，曹振，李召虎，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：11
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