重组马GMCSF的制备方法及相关马GMCSF核苷酸序列技术

本发明专利技术涉及一种重组马GMCSF的制备方法，将经过密码子优化的编码马GMCSF的核苷酸序列构建入原核细胞诱导表达载体中，然后转入原核细胞进行培养后诱导表达，并进行纯化，从而获得重组马GMCSF，较佳地，原核细胞诱导表达载体是非分泌表达载体，在诱导表达后，裂解培养得到的原核细胞，断裂DNA和分离包涵体，包涵体中含有重组马GMCSF，将包涵体溶于变性缓冲液得到变性溶液，然后使变性溶液中的蛋白复性得到复性溶液，再进行纯化，重组马GMCSF最好带有标签，采用相关亲和层析柱层析纯化，本发明专利技术设计巧妙，从而可以高表达、高纯度地获得具有生物学活性的重组马GMCSF，进而可以作为免疫马匹时的佐剂，以增强动物的免疫反应，提高抗体的滴度，适于大规模推广应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因工程
，特别涉及GMCSF制备
，具体是指一种重组马GMCSF的制备方法及相关GMCSF核苷酸序列。
技术介绍
细胞因子(cytokine)是一类机体在免疫反应时产生的免疫调节物质。机体的免疫系统在受到抗原和各种免疫佐剂的刺激后，产生的应答性物质，这类物质统称为细胞因子。天然的细胞因子为哺乳动物产生的蛋白质，多数为分子量较小的单体(1x104-2. 5X104), 也有天然状态为二体或三体的。免疫反应通常是由多种细胞因子参与调节的。细胞因子对抗原递呈细胞(APC)的作用有增加APC的数量和活化APC的功能两个方面。GMCSF (Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor)是一种强烈刺激巨噬细胞和DC等抗原呈递细胞的增殖、分化、活化、成熟及趋化的细胞因子，能促进单核吞噬细胞和颗粒细胞的分化；激活APC的抗原处理和递呈功能；促使B细胞成熟和分泌抗体。 GMCSF可以明显提高机体的体液免疫机能。在被动免疫治疗和预防中，马抗体发挥了无可替代的作用。马抗蛇毒抗体是治疗蛇伤的最快速、最有效的药物；在预防狂犬病中，马抗狂犬病抗体的使用是不可或缺的。因此免疫获得高滴度抗体用以制备高效价的马抗蛇毒、抗狂犬病等抗体具有重要意义。在免疫马匹时佐剂的使用可以大幅提高抗体的滴度，马GMCSF是一种细胞因子，在免疫动物的同时添加马GMCSF可以明显提高抗体的滴度。因此，需要提供一种重组马GMCSF的制备方法，其可以高表达、高纯度地获得具有生物学活性的重组马GMCSF。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种重组马GMCSF的制备方法及相关马GMCSF核苷酸序列， 该重组马GMCSF的制备方法设计巧妙，从而可以高表达、高纯度地获得具有生物学活性的重组马GMCSF，进而可以作为免疫马匹时的佐剂，以增强动物的免疫反应，提高抗体的滴度， 适于大规模推广应用。为了实现上述目的，在本专利技术的第一方面，提供了一种重组马GMCSF的制备方法， 其特点是，将经过密码子优化的编码马GMCSF的核苷酸序列构建入原核细胞诱导表达载体中，然后转入原核细胞进行培养后诱导表达，并进行纯化，从而获得所述重组马GMCSF。其中，培养转化的原核细胞所用的材料不含任何动物或人来源的物质，而且能在发酵过程中获得高细胞密度。培养转化的原核细胞进行在含一种或多种可供选择的材料， 如酵母提取物，甘油和含氮盐类的培养基中实施较佳地，所述核苷酸序列是如SEQ ID NO 1所示的序列。编码如SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列。较佳地，所述培养包括预接种的预备步骤。所述原核细胞可以是任何合适的原核细胞。较佳地，所述原核细胞是细菌细胞。更佳地，所述细菌细胞是大肠杆菌细胞。更进一步地，所述大肠杆菌细胞是大肠杆菌BL21 (DE3)细胞。较佳地，所述诱导表达在培养液的0D_达到1-20时启动。更佳地，所述0D_为5-15。更进一步地，所述OD6tltl为8-12。所述原核细胞诱导表达载体可以是分泌表达载体，也可以是非分泌表达载体。较佳地，所述原核细胞诱导表达载体是非分泌表达载体，在所述诱导表达后，裂解培养得到的原核细胞，断裂DNA和分离包涵体，所述包涵体中含有所述重组马GMCSF，将所述包涵体溶于变性缓冲液得到变性溶液，然后使所述变性溶液中的蛋白复性得到复性溶液，再进行所述纯化。更佳地，所述非分泌表达载体是T7表达载体。更进一步地，所述诱导表达通过乳糖、IPTG或功能相同的类似物进行。更佳地，所述裂解采用冻融法或高压细胞破碎仪进行。还可采用本领域技术人员熟知的其他等同技术实施细胞裂解。更佳地，所述断裂DNA采用生化或物理方法如加入重组来源的DNase或通过化学-机械作用来使DNA断裂。重组来源的DNase优选benzonase。常规通过混和器来使DNA 断裂。更佳地，所述分离包涵体通过至少两个循环的离心和洗涤，洗涤缓冲液内含IM尿素，0. 5-1. OM氯化钠，pH在7. 0-8. 0之间。更佳地，所述变性缓冲液是含尿素、异硫氰酸胍或盐酸胍的变性缓冲液。还可以是含其它变性剂的变性缓冲液。更佳地，所述变性缓冲液加入所述包涵体中并采用勻浆或超声处理从而将所述包涵体溶于所述变性缓冲液。更佳地，所述复性通过在所述变性溶液中添加氧化/还原剂并在温度10_30°C搅拌10-30小时实现。更进一步地，所述温度为20°C，所述搅拌进行20-23小时。更进一步地，在加入所述氧化/还原剂之前，先稀释所述变性溶液至OD28tl达到 0. 01-2，所述氧化/还原剂是氧化型谷胱甘肽和还原型谷胱甘肽，所述氧化型谷胱甘肽的浓度在0. ImM和2. 5mM之间，所述还原型谷胱甘肽的浓度在0. 25mM和6. 25mM之间。尤其更佳地，所述OD28tl达到0. 5。较佳地，所述纯化采用亲和层析将所述重组马GMCSF以单体形式分离。更佳地，所述重组马GMCSF带有6x His标签，所述亲和层析采用Ni-亲和层析柱层析，样品上柱体积/柱体积的比率为10 1至300 1。更进一步地，所述比率为40 1。更进一步地，采用咪唑-NaCl缓冲液作为洗脱液，所述重组马GMCSF主要在 100-250mM咪唑浓度的洗脱组分中。重组GMSCSF纯化后可以进一步超滤浓缩然后添加保护剂和/或冷冻干燥保存。在本专利技术的第二方面，提供了一种密码子优化的编码GMCSF的核苷酸序列，其特点是，所述核苷酸序列是如SEQ ID NO :1所示的序列，适于上述的重组马GMCSF的制备方法。本专利技术的有益效果在于本专利技术的重组马GMCSF的制备方法是将经过密码子优化的编码马GMCSF的核苷酸序列构建入原核细胞诱导表达载体中，然后转入原核细胞进行培养后诱导表达，并进行纯化，从而获得所述重组马GMCSF，表达量可达约200mg/l ；纯度高， 经检测，不含可以用SDS-PAGE或HPLC检测到的细菌菌体蛋白或其它细菌残留物，通过实验表明获得的重组马GMCSF具有生物学活性，因此本专利技术的重组马GMCSF的制备方法设计巧妙，从而可以高表达、高纯度地获得具有生物学活性的重组马GMCSF，进而可以作为免疫马匹时的佐剂，以增强动物的免疫反应，提高抗体的滴度，适于大规模推广应用。附图说明图1是表达马GMCSF的重组大肠杆菌在诱导前和诱导后在还原条件下SDS-PAGE 结果，其中1为蛋白分子量标准，2和5为诱导前样品，3和6为诱导后样品。图2为包涵体变复性前后和Ni-S^harose High Performance金属离子螯合层析纯化后获得的高纯度马GMCSF蛋白SDS-PAGE结果，其中1为蛋白分子量标准；2为包涵体洗涤后加变性缓冲液BD后获得的蛋白溶液；3为变性蛋白溶液复性后的样品；4为复性样品过Ni-S^harose High Performance金属离子螯合层析并用250mM咪唑溶液洗脱获得的纯化重组马GMCSF。图3是将带有6x His标签的密码子优化的马GMCSF的核苷酸序列通过NdeI和 XhoI酶切位点构建入pET30a(+)获得的重组质粒图谱示意图。具体实施例方式为了达到使马GMCSF在原核细胞内高表达这个目的，通过查文献得到该完整基因的氨基酸序列(即SEQ 本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种重组马ＧＭＣＳＦ的制备方法，其特征在于，将经过密码子优化的编码马ＧＭＣＳＦ的核苷酸序列构建入原核细胞诱导表达载体中，然后转入原核细胞进行培养后诱导表达，并进行纯化，从而获得所述重组马ＧＭＣＳＦ。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王静，范志和，杨涛，孙九如，
申请(专利权)人：上海赛伦生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：31