本发明专利技术公开了基于易错PCR技术提高内切葡聚糖酶的活性的方法，包括以下步骤：A1，获得突变内切葡聚糖酶基因；A2，内切葡聚糖酶大肠杆菌突变体库的构建；A3，高酶活菌株的筛选；A4，高酶活菌株突变基因的分析；实现了对来源于枯草芽孢杆菌C-36的内切葡聚糖酶基因进行体外定向进化，并在大肠杆菌中构建突变体库，筛选出一株酶活显著提高的菌株，为碱性内切葡聚糖酶的工业应用奠定了基础。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术提供一种基于易错PCR技术提高内切葡聚糖酶的活性的方法，属于生物工程
技术介绍
资源和环境问题是人类在21世纪面临的最主要的挑战。而纤维素是地球上最丰富、最廉价的可再生资源。纤维素这一巨大可再生资源的有效利用对解决环境污染、食品短缺、能源危机具有重大现实意义，利用微生物产生的纤维素酶来分解和转化纤维素则是纤维素利用的有效途径。但目前纤维素酶的高成本和低酶活，影响了纤维素酶的工业化生产和广泛应用。因此通过基因工程和蛋白质工程技术对内切葡聚糖酶进行改造具有重要的科学和实用价值。芽孢杆菌能产生中性或偏碱性内切葡聚糖酶，它不同于以往绝大多数的真菌产生的酸性内切葡聚糖酶，能够应用于棉纺织品水洗整理工艺及洗涤剂工业中，对其的研究是目前的热点。然而，自然界筛选出来的菌株都有酶活较低，且表达量不太稳定。易错PCR技术是定向进化研究最早采用的一种构建基因文库的方法。首次提出易错PCR是Leimg等人。易错PCR是指通过改变PCR的反应条件，如调整反应体系中4种 dNTP的浓度、增加Mg2+的浓度、加入Mn2+或使用低保真度Taq酶等，使碱基在一定程度上随机错配而引入多点突变，构建突变库，筛选出所需的突变体。易错PCR的关键是控制DNA的突变频率。如果DNA的突变频率太高，产生的绝大多数酶将失去活性；如果突变频率太低， 野生型的背景太高，样品的多样性则较少。对于每一 DNA序列来说，合理的碱基突变数是 1-3个。理想的碱基置换率和易错PCR的最佳条件则依赖于随机突变的目标DNA片段的片段长度。在该方法中，遗传变化只发生在单一分子内部，所以属于无性进化。由于它较为费力、 耗时，一般多用于较小基因片段(< 800bp)的改造。在通常情况下，经一轮的易错PCR、定向筛选，很难获得令人满意的结果，由此发展出了连续易错PCR(Sequential error-prone PCR)，该方法是将一次PCR扩增得到的有益突变基因作为下一次PCR扩增的模板，连续反复进行随机诱变，使得每一次获得的少量突变累积而产生重要的有益突变。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对目前碱性内切葡聚糖酶酶活低、难以满足工业生产需要的缺点，对来源于枯草芽孢杆菌的内切葡聚糖酶基因进行定向进化，筛选出酶活显著提高的突变体，为内切葡聚糖酶工业应用奠定基础。本专利技术的具体实施步骤如下1、获得突变内切葡聚糖酶基因(1)接种一环含有pMD19-T_Cen质粒的大肠杆菌DH5 α于IOmL LB (Amp)液体培养基中37°C培养过夜，使用质粒提取试剂盒按说明提取pMD19-T-Cen质粒。提取的质粒通过 Bgl II，Sph I双酶切对其进行检测，检测正确后作为易错PCR的模板。(2)调整反应参数和反应体系，通过引物Pl :5’ -TAATCCAACCCGGAATTCGCAGAGACAAAAACGCCAGTAGC-3，P2 :5’ TAGGAAAGGAAAAAAGCGGCCGCCTAATTTGGTTCTGTTCCCCAAA-3’进行易错PCR。反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳，使用纯化试剂盒对易错PCR产物进行纯化回收。2、内切葡聚糖酶大肠杆菌突变体库的构建(1)将回收的易错PCR突变的内切葡聚糖酶基因库经EcoR I，NotI双酶切后，连入同样经过EcoR I，NotI双酶切的含有T71ac启动子和氨苄青霉素抗性基因的表达载体 pET-32a(+)中。(2)大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞的制备方法为将E. coli BL21划线接种LB 平板，37°C培养直至长出单菌落；挑取一个单菌落，接种至含有IOmL LB培养基的50mL三角瓶中，37°C，170rpm培养过夜；将上述培养液按接种量接种到50mL LB液体培养基中， 37°C，170rpm振荡培养1. 5-2小时；将培养后的菌液置冰浴中，使培养物冷却到0°C，IOmin 后转移到无菌的50mL离心管中，40C，4300rpm离心5min，倒掉上清液；向管中加入30mL无菌预冷的0. lmol/L CaCl2-MgCl2溶液重新悬浮菌体，4°C，4300rpm离心8min，去掉上清液； 向管中加入2mL无菌预冷的0. ImoVLCaCl2溶液重新悬浮菌体；(3)取一支装有100 μ L Ε. coli BL21感受态细胞，置冰浴中解冻；将过夜连接产物全部加入到上述Ep管中，并用加样器轻轻混合均勻；将Ep管冰浴30min ；将Ep管放入 42°C恒温水浴中热击90-120秒；迅速将Ep管置冰浴中静置5min ；向Ep管中加入800 μ L LB液体培养基置37°C摇床培养60min，使细菌复苏并表达质粒编码的抗生素抗性标记基因；取培养后的菌液200 μ L用玻棒涂布在LB (Amp)平板上，将平板置37°C恒温培养箱培养直至液体被吸收后，将平板倒置继续培养12-1 后直至单个菌落出现，即为含有突变内切葡聚糖酶基因Cerfp的突变体库。3、高酶活菌株的筛选(1)将LB(Amp)平板上长出的菌落(构建好的突变体库，平板上每个菌落就是一个克隆子)一一对应转入LB (Amp)平板和LB (Amp、IPTG、CMC-Na)平板上，转板后将平板置37°C恒温培养箱培养，LB(Amp)平板培养他后取出放入4°C冰箱保存，LB(Amp, IPTG、 CMC-Na)平板继续培养36h，然后采用刚果红染色法观察水解圈的大小，同时每个平板分别以原始菌和不含有内切葡聚糖酶基因的空载体作为阳性和阴性对照。看水解圈的大小筛选出目的菌株，再对应从氨苄青霉素平板上找出目的克隆菌株。(2)将初步筛选得到的酶活性提高的阳性克隆子接种IOmL LB(Amp)液体培养基，37°C、170rpm培养过夜，再以的接种量接种到20mL LB(Amp)液体培养基中，37°C， 170rpm振摇培养至对数生长期(0D值0. 6 0. 8)，补加终浓度为lmmol/L的IPTG诱导培养4 他，破碎细胞测其上清液酶活。4、高酶活菌株突变基因的分析复筛出来的酶活提高的菌株用质粒提取试剂盒提取质粒后转入大肠杆菌DH5 α， 用质粒提取试剂盒提取质粒，酶切验证导入基因的正确性，并挑取阳性菌株送^witrogen 公司测序。对测序结果进行分析，找出突变碱基位点和氨基酸位点，并对催化结构域三级结构进行预测和比较。SDS-PAGE分析表达量的变化。本专利技术利用易错PCR技术和常规的突变体库构建技术，对来源于枯草芽孢杆菌的内切葡聚糖酶基因进行体外定向进化，并在大肠杆菌中构建突变体库，筛选出一株酶活显著提高的菌株，为碱性内切葡聚糖酶的工业应用奠定了基础。附图说明图la :pMD19-T-Cen质粒酶切电泳检测泳道2、3依次为，Bgl Il.Sph I双酶切后回收的pMD19-T载体，目的基因片段；图Ib 易错PCR扩增产物电泳检测泳道1为易错PCR后回收的目的基因片段。图2 易错PCR产物、pET32a(+)质粒酶切电泳检测泳道1_2依次为易错PCR产物双酶切后回收，pET32a(+)质粒双酶切后回收；图3 :目的克隆菌株8号为原始菌株，12号为筛选出来的突变菌株；图如突变菌株质粒酶切电泳检测泳道1、2依次为，EcoR I、NotI，双酶切，EcoR I单本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．基于易错ＰＣＲ技术提高内切葡聚糖酶的活性的方法，其特征在于，包含以下步骤：Ａ１，获得突变内切葡聚糖酶基因；突变模板的准备：接种一环含有ｐＭＤ１９－Ｔ－Ｃｅｎ（构建载体酶切位点为Ｂｇｌ ＩＩ，Ｓｐｈ Ｉ）质粒的大肠杆菌ＤＨ５α于１０ｍＬＬＢ（Ａｍｐ）液体培养基中３７℃培养过夜，使用质粒提取试剂盒按说明提取ｐＭＤ１９－Ｔ－Ｃｅｎ质粒；提取的质粒通过Ｂｇｌ ＩＩ，Ｓｐｈ Ｉ双酶切对其进行检测，检测正确后作为易错ＰＣＲ的模板；通过引物Ｐ１：５’－ＴＡＡＴＣＣＡＡＣＣＣＧＧＡＡＴＴＣＧＣＡＧＡＧＡＣＡＡＡＡＡＣＧＣＣＡＧＴＡＧＣ－３’Ｐ２：５’－ＴＡＧＧＡＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＡＡＴＴＴＧＧＴＴＣＴＧＴＴＣＣＣＣＡＡＡ－３’进行易错ＰＣＲ；反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳，使用纯化试剂盒对易错ＰＣＲ产物进行纯化回收；Ａ２，内切葡聚糖酶大肠杆菌突变体库的构建；将步骤Ａ１回收的所述易错ＰＣＲ产物经ＥｃｏＲ Ｉ、ＮｏｔＩ双酶切后，连接入经过同样ＥｃｏＲ Ｉ、ＮｏｔＩ双酶切的含有Ｔ７ｌａｃ启动子和氨苄青霉素抗性基因的表达载体ｐＥＴ－３２ａ（＋）中；使用化学热击转化的方法，将含有突变的内切葡聚糖酶基因库的表达载体质粒转入大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）感受态细胞，涂布至ＬＢ（Ａｍｐ）平板，即得构建好的突变体库；Ａ３，高酶活菌株的筛选；将ＬＢ（Ａｍｐ）平板上长出的菌落一一对应转入的ＬＢ（Ａｍｐ）平板和ＬＢ（Ａｍｐ、ＩＰＴＧ、ＣＭＣ－Ｎａ）平板上，转板后将平板置３７℃恒温培养箱培养，ＬＢ（Ａｍｐ）平板培养８ｈ后取出放入４℃冰箱保存，ＬＢ（Ａｍｐ、ＩＰＴＧ、ＣＭＣ－Ｎａ）平板继续培养３６ｈ，然后采用刚果红染色法观察水解圈的大小，同时每个平板分别以原始菌和不含有内切葡聚糖酶基因的空载体作为阳性和阴性对照；根据水解圈的大小筛选出目的菌株，再对应从ＬＢ（Ａｍｐ）平板上找出目的克隆菌株；初筛出来的阳性克隆子，通过扩大诱导培养，破壁后测定酶活。Ａ４，高酶活菌株突变基因的分析：复筛出来的酶活提高的菌株用质粒提取试剂盒提取质粒后转入大肠杆菌ＤＨ５α，用质粒提取试剂盒提取质粒，酶切验证导入基因的正确性，并挑取阳性菌株送Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司测序；对测序结果进行分析，找出突变碱基位点和氨基酸位点，并对催化结构域三级结构进行预测和比较；ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析表达量的变化。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈惠，姚友旭，廖燕，吴琦，李春梅，李雨霏，阮景军，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：90
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