本发明专利技术涉及一种用酶标法测定海马幼苗组织消化酶活力的方法，包括：1)将冰冻海马幼苗加入到容器中，冰浴下再加入0.7％NaCl的生理盐水或匀浆介质后，用多功能样品均质器匀浆，离心机离心，取上清液备用；2)取部分上述上清液测定组织总蛋白浓度；3)取容器A、B，分别加入底物淀粉缓冲液，再向B中加入步骤1)所得上清液，然后分别在A、B中各加入碘反应液和蒸馏水；4)吸取A、B中溶液分别滴入酶标板的两个孔中；随后将上述的酶标板放入酶标仪中，同时检测两孔中溶液的吸光度；5)最后计算样品的淀粉酶活力。本发明专利技术的方法操作简单，成本低廉，效率高，且环保无污染。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于消化酶活力的测定领域，特别涉及。
技术介绍
海马是传统的名贵中药，具有很高的经济价值。近年来，海马被当作高级观赏动物，使其价值大涨。但由于自然资源破坏严重，供应满足不了需求，人工养殖成了唯一选择。 在海马幼苗养殖中，饵料营养是否足够，环境条件是否适宜均成为影响海马育苗成功与否的重要因素。消化酶活力在水产研究中是反映鱼类对不同营养物质利用能力的重要指标。 除饵料营养外，环境因子等也可影响机体的消化酶活力，因此消化酶活力也可以作为反应环境好坏的指标之一。在实际生产中，海马与其他鱼类的死亡往往发生在初孵幼苗阶段。而此时，人们往往通过对大量幼苗组织进行生化分析，来判断其营养状况和对环境的适应程度。而传统的消化酶分析方法存在以下问题1)往往需要重量达数百毫克的幼体组织，这就需要消耗数十甚至成百上千只幼体。2)需要自行配置分析试剂或购买商用试剂盒。而试剂盒的价格也往往达到数百乃至上千元。幻实验测试前的组织勻浆，往往采用手动玻璃勻浆器或高速勻浆机，但一般每次只能勻浆一个样品。4)吸光度读取时，一般采用光程为Icm的比色杯在分光光度计下读取。而在一些科学研究中，有时一次就需要分析数百份样本。这不但需要高昂的分析费用，同时也需要消耗大量的人力物力。且由于大量样本的测试过程需要花费十几甚至数十天，这极大增加了测试过程跨越时间长所造成的偏差。而需要一种高效，且对研究材料和研究试剂需求量大大减少的方法，对消化酶活力进行分析。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供，该方法操作简单，成本低廉，效率高，且环保无污染。本专利技术的，包括1)将冰冻海马幼苗10_20mg加入到容器中，冰浴下再加入90_180μ 1 2_4°C 的0. 7 % g/mlNaCl的生理盐水或勻浆介质后，勻浆成勻浆液，然后再于冷冻离心机中 0-40C 9000-10000rpm下离心lOmin，取上清液备用；2)取上述上清液，采用考马斯亮蓝G250法测定组织总蛋白浓度，其中牛血清白蛋白为标准蛋白；3)取两个干净的容器A、B,分别加入等体积的试剂盒中的“底物淀粉缓冲液”(南京建成生物工程研究所)50ul，再向B中加入步骤1)所得上清液IOul，并震荡B ；然后将A、 B于37°C恒温水浴中加热7. 5min后再各加入等体积浓度为0. Olmol/L的碘反应液50ul，最后在A、B中各加入蒸馏水300-310ul，使得A、B中溶液的体积相等，再同时震荡A、B ；4)从上述A、B中各吸取等体积的溶液，分别滴入酶标板的两个孔中；将酶标仪波长调至660nm，随后将上述的酶标板放入酶标仪中，同时检测两孔中溶液的吸光度；5)最后根据公式计算样品的淀粉酶活力.A-R η 4-χ O HcI由AMS活力(UMsprot) = ^x X+ (取样量X组织总蛋白浓度)AIU 7.5分钟AMS表示酶活力，U/mgprot为酶活力单位；A表示A的吸光度，B表示B的吸光度；0. 4和0. 05分别表示“底物淀粉缓冲液”的浓度0. 4mg/ml和用量的毫升数(50ul = 0. 05ml) ；30分钟和10表示反应30分钟消耗IOmg淀粉作为一个酶活力单位；7. 5分钟是本实验于37°C恒温水浴中实际加热7. 5分钟；取样量为步骤3)中取用的上清液的体积(ml)， 组织总蛋白浓度为步骤2、中测试所得的组织总蛋白浓度。上述步骤1)中所述的勻浆介质为pH值为7.4，且含有0.0111101/1 Tris (三羟甲基氨基甲烷)-HC1，0. 0001mol/L EDTA_2Na(乙二胺四乙酸二钠)，0. 01mol/L 蔗糖，0. 8 % g/ mlNaCl的水溶液。上述步骤1)中所述的勻浆成勻浆液过程中，使用的是多功能样品均质器 (BertinPrecellys-M，法国白金公司)。上述步骤1)中所得的上清液中IOul准备用于淀粉酶活力测定，剩余可用作组织总蛋白含量测定、脂肪酶活力测定、蛋白酶活力测定。上述步骤2~)中所取上清液的体积为80-160ul。上述步骤3)中所述的容器A、B，其中A为空白对照，B用于样品的测定。上述步骤3)中所述的震荡均为用旋窝振荡器震荡。本专利技术的方法简便易学，实验材料用量和实验试剂成本均减少到普通检测时的 0. 1倍，组织勻浆效率最多可提高M倍，吸光度读取效率最多可提高96倍。在测吸光度的溶液为270ul，约为普通分光光度法检测时的0. 1倍(光程为Icm比色杯容积为3000ul)。 因此，步骤1中幼体组织用量也可按比例降为普通检查时的0. 1倍；化学反应中试剂盒试剂的用量，也按比例缩小到了普通情况的0. 1倍；选用 BertinPrecellys-24多功能样品均质器，可以同时勻浆M个样品，且每次勻浆时间约为 aiiin。而普通手动勻浆每人每次只能勻浆一个样品，每个样品需要aiiin。据此推算该步骤的效率将提高M倍。本专利技术选用了 96孔酶标版和酶标仪(酶标法)进行吸光度的测试，本专利技术在 3-5min内可以一次性最多检测96个样品，其效率是普通普通检测(分光光度法)时的96 倍。而且96孔板为无污染一次性耗材，且价格低廉。有益效果本专利技术的方法操作简单，成本低廉，效率高，且环保无污染。 具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。此外应理解，在阅读了本专利技术讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本专利技术作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。实施例11)将冰冻海马幼苗IOmg加入到1. 5ml容器中，冰浴下再加入90 ill 4°C左右的 勻菜介质(pH 7. 4,0. Olmol/L Tris-HCl,0. OOOlmol/L EDTA-2Na，0. Olmol/L 蔴糖，0. 8 % g/mlNaCl溶液)，勻菜成勻菜液，然后再于TGL-16G型冷冻离心机中4°C，9000rpm下离心 IOmin，取上清液80ul，其中20ul用作以下检测，另60ul可留作他用；2)取上述上清液IOul采用考马斯亮蓝G250法測定组织总蛋白浓度为0. 34mg/ ml，其中牛血清白蛋白为标准蛋白；3)取两个干净的容器A、B,分別加入50ul试剂盒中的“底物淀粉缓冲液”，再向B 中加入IOul步骤1)所得上清液，并用旋窝振荡器震荡B，使试剂充分混勻；然后将A、B于 37°C恒温水浴中加热7. 5min，取出后分別在A、B中各加入50ul浓度为0. Olmol/L的碘反 应液，在A中加入蒸溜水310ul，B中加入蒸溜水300ul，再用旋窝振荡器同时震荡A、B ；4)用移液器从A、B中各吸取溶液270ul，分別滴入孔容积为405ul酶标板的两个 孔中；将酶标仪波长调至660nm，随后将上述的酶标板放入酶标仪中，同时检测两孔中溶液 的吸光度为0. 38.0. 29 ；5)根据公式计算出样品的酶活力为0. 56U/mgprot。权利要求1.，包括1)将冰冻海马幼苗10-20mg加入到容器中，冰浴下再加入90-180μ1 2_4°C左右的0. 7 % g/mlNaCl的生理盐水或勻浆介质后，勻浆成勻浆液，然后再于冷冻离心机中 0-40C 9000-10000rpm下离心本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种用酶标法测定海马幼苗组织消化酶活力的方法，包括：１）将冰冻海马幼苗１０－２０ｍｇ加入到容器中，冰浴下再加入９０－１８０μｌ ２－４℃左右的０．７％ｇ／ｍｌＮａＣｌ的生理盐水或匀浆介质后，匀浆成匀浆液，然后再于冷冻离心机中０－４℃９０００－１００００ｒｐｍ下离心１０ｍｉｎ，取上清液备用；２）取上述上清液，采用考马斯亮蓝法测定组织总蛋白浓度，其中牛血清白蛋白为标准蛋白；３）取两个干净的容器Ａ、Ｂ，分别加入等体积的试剂盒中的“底物淀粉缓冲液”５０ｕｌ，再向Ｂ中加入步骤１）所得上清液１０ｕｌ，并震荡Ｂ；然后将Ａ、Ｂ于３７℃恒温水浴中加热７．５ｍｉｎ后再各加入浓度为０．０１ｍｏｌ／Ｌ的碘反应液５０ｕｌ，最后在Ａ、Ｂ中各加入蒸馏水３００－３１０ｕｌ，使得Ａ、Ｂ中溶液的体积相等，再同时震荡Ａ、Ｂ；４）从上述Ａ、Ｂ中各吸取等体积的溶液，分别滴入酶标板的两个孔中；将酶标仪波长调至６６０ｎｍ，随后将上述的酶标板放入酶标仪中，同时检测两孔中溶液的吸光度；５）最后计算样品的淀粉酶活力。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：尹飞，孙鹏，彭士明，施兆鴻，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院东海水产研究所，
类型：发明
国别省市：31
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