本发明专利技术涉及一种协同刺激分子修饰胎盘成体干细胞活细胞制剂及其制备与应用。其制剂是在2ml的冻存管中保存有5×105个培养5代的协同刺激分子修饰胎盘成体干细胞，冻存液为人的AB血浆，总体积为1ml，于-196℃液氮中保存待用。其制备方法是在无菌条件下分五个步骤：1.处理胎盘组织，2.分离胎盘成体干细胞，3.胎盘成体干细胞的扩大培养，4.胎盘成体干细胞的基因修饰，5.胎盘成体干细胞活制剂的制备。本发明专利技术制剂具有广谱的抗肿瘤效果，直接作用于肿瘤干细胞而抑制多种肿瘤的发生、演进和转移，从根源阻止肿瘤的发生发展。制剂取材方便，无伦理道德问题，资源丰富，制备简便，成本低廉，为肿瘤治疗提供新的策略。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医学工程技术，特别是一种用协同刺激分子修饰胎盘成体干细胞制作的活细胞制剂及其制备与应用。
技术介绍
胎盘成体干细胞是来源于新生儿胎盘组织的一族亚全能干细胞，其在发育阶段与胚胎干细胞接近，又具备多能成体干细胞的许多生物学特征，使用不需配型，数量丰富，分化能力强，可定向分化为间充质干细胞、血管干细胞、上皮干细胞、神经干细胞、肝干细胞等多种干细胞，同时不产生肿瘤。胎盘作为胚胎发育中维系母体和胎儿氧气及营养物质交换的暂时性器官，由起源于细胞滋养层及胚外中胚层的胎儿丛密绒毛膜与母体子宫的基蜕膜共同组成，无论从解剖结构还是发育生物学上，都包含了较为幼稚的胚胎及趋于成熟的成体干细胞成分；胎盘在胎儿娩出后即完成使命，成为“废弃”物，对其研究不会涉及伦理道德问题。肿瘤特别是恶性肿瘤发病率日益增高，且传统治疗如手术、放疗、化疗难以彻底清除残存的肿瘤细胞，特别是肿瘤干细胞，导致其治愈率低，复发率和病死率高，成为严重危害人类健康的最大敌人，肿瘤的防治就显的极为迫切。越来越多研究表明肿瘤干细胞 (cancer stem cells,CSCs)是肿瘤形成的起始细胞与肿瘤转移的先锋细胞，同时也为肿瘤复发的根源。当今肿瘤防治技术方法并不少，且均有一定的作用，但远期效果都欠佳，究其根本原因就在于这些方法在设计上都没针对肿瘤干细胞。因此，很有必要设计一些定向肿瘤干细胞的新技术来防治发病率与日俱增的肿瘤，尤其是能刺激宿主打破对肿瘤干细胞的多重免疫麻痹的新策略。
技术实现思路
本专利技术正是为了克服上述现有技术中的不足，打破在肿瘤形成过程中与肿瘤建立后宿主对肿瘤干细胞产生多重免疫麻痹，从而阻止肿瘤的发展与演进，设计出定向肿瘤干细胞的新策略协同刺激分子修饰胎盘成体干细胞活制剂及制备与应用。胎盘成体干细胞介于较为幼稚的胚胎及趋于成熟的成体干细胞之间，是比骨髓干细胞更为原始的祖细胞。研究表明胎盘成体干细胞和肿瘤干细胞在抗原表达、分化潜能等生物学特性具有极大的相似性(1)高表达肿瘤胚胎发生抗原，包括免疫原性与反应原性， 二者之间可能具有交叉免疫性，( 无限增殖潜能，(3)自我分化能力(4)逃逸免疫系统的识别，( 诱导血管生长因子的产生。特别是转染后表达协同刺激分子的胎盘成体干细胞制剂。本专利技术的任务是这样实现的协同刺激分子修饰胎盘成体干细胞活制剂，是在 2ml的冻存管中保存有培养5代后的重组协同刺激分子修饰的胎盘干细胞活制剂，干细胞为5 X IO5个，冻存液为人的AB血浆，总体积为1ml，于_196°C液氮中保存待用。上述协同刺激分子修饰胎盘成体干细胞活制剂的制备方法其操作是在无菌条件下分为以下五个步骤制备(1)处理胎盘组织，(2)分离胎盘成体干细胞，(3)胎盘成体干细胞的扩大培养，(4)胎盘成体干细胞的基因修饰( 胎盘成体干细胞活制剂的制备。本专利技术生产的协同刺激分子修饰胎盘成体干细胞活制剂的应用，是对肿瘤干细胞产生直接作用而达到抑制肿瘤的发生、发展与演进，作为一种广谱抗肿瘤制剂应用。本专利技术的胎盘成体干细胞制剂的使用选择在肿瘤发生之后，选择最常见的肿瘤肺癌、乳腺癌、肝癌、结肠癌为治疗模型，注射部位选择肿瘤对侧方皮下，为打破肿瘤免疫逃逸机制，首次免疫治疗10天后再进行一次加强免疫治疗。附图说明以下是本专利技术说明书附图的图面说明图1是本专利技术(A)肿瘤干细胞(CSCs)，(B)骨髓干细胞(BSCs)，(C)单纯胎盘干细胞(PSCs)与(D)协同刺激分子修饰胎盘成体干细胞(Co-PSCs)显微相差比较。图2是本专利技术肺癌的干细胞治疗模型疗效比较，实验组应用胎盘成体干细胞活制剂治疗后肿瘤体积明显小于对照组，尤其是协同刺激分子修饰胎盘成体干细胞活制剂 (Co-PSCs,即本专利技术制剂)治疗组大部分宿主的肿瘤明显消退。图3是本专利技术乳腺癌的干细胞治疗模型疗效比较，实验组应用胎盘成体干细胞活制剂治疗后肿瘤体积明显小于对照组，尤其是本专利技术制剂治疗组(Co-PSCs)大部分宿主的肿瘤明显至完全消退。图4是本专利技术肝癌的干细胞治疗模型疗效比较，实验组应用胎盘成体干细胞活制剂治疗后肿瘤体积明显缩小，尤其是本专利技术制剂治疗组(Co-PSCs)大部分荷瘤宿主的肿瘤显著消退。图5是本专利技术结肠癌的干细胞治疗模型疗效比较，实验组应用胎盘成体干细胞活制剂治疗后肿瘤体积明显小于对照组，尤其是本专利技术制剂治疗组(Co-PSCs)大部分荷瘤宿主的肿瘤完全消退。图6(A)是本专利技术制剂注射后抑制肿瘤干细胞的增殖与对照组(Control)、骨髓干细胞组(BSCs)及单纯胎盘干细胞组(PSCs)相比，肿瘤组织的⑶133/MUC-1免疫组化染色显示协同刺激分子修饰胎盘成体干细胞(Co-PSCs，本专利技术制剂)治疗组的肿瘤组织中肿瘤干细胞明显少于对照组，结果有统计学意义(*P<0.05)。(B)是本专利技术制剂注射激活NK 细胞肿瘤组织CD57、DX5免疫组化染色显示本专利技术制剂治疗组(Co-PSCs)肿瘤内活化NK 细胞明显多于其它各组，结果有统计学意义(*P < 0. 05)。图7(A)是本专利技术制剂注射后增加T细胞活性与对照组(Control)、骨髓干细胞组(BSCs)，及单纯胎盘干细胞组(PSCs)相比，肿瘤组织的T细胞免疫组化染色显示本专利技术制剂治疗组(Co-PSCs)的肿瘤组织中活化CD8+T和CD4+T细胞(箭头)明显多于对照组，结果有统计学意义(*P<0. 05)。(B)是本专利技术制剂注射后增加淋巴细胞分泌干扰素=Elispot 分析显示本专利技术制剂治疗组(Co-PSCs)体内淋巴细胞分泌的干扰素-Y (IFN-γ，介导抗肿瘤细胞免疫)及白介素_4(IL-4，介导抗肿瘤体液免疫)高于对照组，尤其是IFN-γ显著增高，结果有统计学意义(*P < 0. 05)。本专利技术与现有技术相比具有以下优点1.该抗肿瘤制剂采用协同刺激分子修饰胎盘成体干细胞制作，一方面提高了干细胞的免疫原性使宿主对肿瘤干细胞产生有效的致敏淋巴细胞与免疫抗体，诱导机体对肿瘤产生特异性杀伤作用，产生特异性抗肿瘤细胞与体液免疫；另一方面还激活了 NK和CD8+T 细胞，分泌TNF-α、IFN-Y等多种细胞因子，以非特异杀伤肿瘤细胞，发挥非特异性的抗肿瘤作用，两条抗肿瘤途径相辅相成，从根源上抑制肿瘤干细胞在体内的增殖成瘤、发展与转移。治疗上采用10天间断性方案，首次治疗10天后进行一次加强免疫治疗，最大限度打破机体对肿瘤的免疫耐受，起到促使肿瘤消退的作用；2.具有广谱的抗肿瘤效果，抑制多种肿瘤的发生、演进和转移，延长荷瘤宿主的生4存期；3.胎盘成体干细胞对协同刺激分子的表达起到保护及缓释的作用，长效刺激机体，防止宿主产生免疫麻痹，激发更强的抗肿瘤免疫反应；4.胎盘成体干细胞为正常细胞，作为细胞治疗制剂，经反复验证不存在体内成瘤的安全问题；5.胎盘取材方便，无痛苦，少污染，不涉及伦理道德问题。6.该生物制剂来自胎盘，资源丰富，制备简便，成本低廉，具有大规模工程化培养的可能，为肿瘤生物学治疗提供潜在的理想资源。具体实施方式本专利技术以下将结合实施例和说明书附图作进一步详述实施例1. 一种协同刺激分子修饰胎盘成体干细胞活制剂是在2ml的冻存管中保存有培养5代后的重组协同刺激分子修饰的胎盘成体干细胞活制剂(参见说明书附图1D)本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种协同刺激分子修饰胎盘成体干细胞活制剂，其特征在于：是在２ｍｌ的冻存管中保存有培养５代后的重组协同刺激分子修饰的胎盘成体干细胞活制剂，干细胞为５×１０５个，冻存液为人的ＡＢ血浆，总体积为１ｍｌ，于－１９６℃液氮中保存待用。
【技术特征摘要】
1.一种协同刺激分子修饰胎盘成体干细胞活制剂，其特征在于是在2ml的冻存管中保存有培养5代后的重组协同刺激分子修饰的胎盘成体干细胞活制剂，干细胞为5X IO5 个，冻存液为人的AB血浆，总体积为1ml，于_196°C液氮中保存待用。2.制备权利要求1协同刺激分子修饰胎盘成体干细胞活制剂的方法，其特征在于于无菌条件下分为以下五个步骤制备(1)处理胎盘组织足月生产的胎盘组织，捐献者均签署知情同意书，并经过医院伦理委员会同意，将胎盘组织剪碎成IcmX IcmX Icm大小，5倍于胎盘组织体积的D-Hank’ s平衡盐液冲洗3次后收集胎盘组织小块；(2)分离胎盘成体干细胞将胎盘组织小块以比例每Iml胎盘组织小块加入5ml0. 2% 胶原酶液，37°C消化50min，消化终止后用200目滤网过滤，收集单细胞，在收集到的单细胞中以比例Iml细胞体积加入3 5ml红细胞裂解液，4°C水浴5min以去除红细胞，再以 5倍于胎盘细胞体积的D-Hank’ s平衡盐液洗一遍，以50倍于胎盘细胞的体积加入配好的低糖DMEM培养基...
【专利技术属性】
技术研发人员：魏于全，陈县城，张冬梅，宋娜，陈巧玲，杨莉，
申请(专利权)人：四川大学，
类型：发明
国别省市：90
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