一种痘苗病毒穿梭载体及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种用于构建重组痘苗病毒的痘苗病毒穿梭载体，该载体含有根据痘苗病毒胸苷激酶基因TK及其侧翼序列设计的同源重组臂TKL和TKR，在TKL和TKR之间存在有三个或三个以上独立的外源基因表达盒。通过其所制备的重组痘苗病毒不仅能够在早、晚期全程高效表达至少三种不同的目的基因，而且通过敲除TK对病毒进行了致弱，提高了临床应用的安全性。本发明专利技术解决了以往重组痘苗病毒安全性低、目的基因表达效率不高，目的基因表达周期不连贯和插入外源基因片段少等问题，为新型基因工程活病毒载体疫苗的研制以及生物技术药物的研发奠定了坚实基础。

【技术实现步骤摘要】

本 专利技术属于生物
，特别涉及一种痘苗病毒穿梭载体及其应用。
技术介绍
消灭天花是人类医学史上最伟大的成就，此过程中痘病毒起了决定性的作用。而痘苗病毒作为痘病毒科正痘病毒属的一员，是目前已知结构上最为复杂的一种病毒，其作为预防天花的疫苗已经使用了 200多年，也是当前世界各国用来预防天花的储备疫苗。痘苗病毒天坛株(vaccinia virus Tian Tan, VTT)是中国特有的痘苗病毒毒株，曾作为预防天花流行的疫苗株在我国大量人群中长期使用过，其具有相对毒力较弱、使用安全的特点， 是研制适用于中国应用的基因工程活病毒载体疫苗的理想毒株。随着基因工程和分子生物学技术的发展，在对痘苗病毒进行不断研究和解析的基础上，该病毒在医学和生物学领域的应用不断深入。特别是1982年，Paoletti和Moss研究组首次成功应用痘苗病毒作为载体在哺乳动物中表达外源基因以来，该载体被广泛用于外源基因的表达调控、新型多肽、基因工程亚单位疫苗以及重组活病毒载体疫苗的制备研究。 1987年，表达狂犬病病毒G基因的重组痘苗病毒首先获准在野生动物中使用，并成功控制了欧洲和北美地区野生动物狂犬病；1990年表达新城疫病毒F基因的重组痘苗病毒在美国注册；1994年表达新城疫病毒HN和F基因的重组痘苗病毒作为首个基因工程活载体疫苗在美国获准批量生产。随着重组痘苗病毒在兽医药领域的成功应用，人们开始将目光投向其医用价值。1996年美国启动了用于治疗恶性黑色素瘤的重组痘苗病毒Aldesleukin的I 期临床试验，并于2001年完成了该项目的II期临床试验；2003年用于预防艾滋病的重组痘苗病毒ITV完成了 I/II期临床试验。目前，全球仍有百余项以重组痘苗病毒为生物制剂的研究处于医学临床试验阶段，涉及癌症、艾滋病、肝炎、疟疾和结核等多种疾病的预防和治疗领域。用痘苗病毒(vaccinia virus, VV)作为真核表达载体，与其他哺乳动物病毒表达载体如逆转录病毒、人单纯疱疹病毒和腺病毒等相比，具有自身独特的优势，主要表现在 ①包装容量大，痘苗病毒基因组中有许多复制非必需基因，约占整个开放阅读框的15%，它们的缺失并不影响病毒在细胞中正常的复制周期，所以其可以插入总量达25kb的外源基因，具有很大的包装容量，并且插入的外源基因可以稳定的遗传和表达；②免疫原性高，夕卜源蛋白在宿主细胞内能被忠实表达，并能进行正确的翻译后加工和修饰，表达的蛋白具有完全天然的构象和生物学活性，可诱导机体产生长效的细胞免疫和体液免疫；③安全性高， 严格的胞浆内复制，不与宿主细胞的基因组整合，无致癌性，这消除了重组痘苗病毒应用后的遗传威胁；④宿主范围广，痘苗病毒能感染包括人、鼠、猪、狗、猴、兔、鸡等在内的大多数哺乳动物和禽类，也可以在相应的细胞系中繁殖；⑤易于构建多价疫苗，在痘苗病毒不同的非必需区可同时插入不同的外源基因，这些基因之间的表达相互独立，彼此不受干扰，因此，痘苗病毒特别适合构建多价疫苗，以实现不同有效成分的组合来提高疫苗的保护效率； ⑥操作简便，不需要辅助病毒或包装细胞；⑦作为预防或治疗性生物制剂的安全性和有效性已被大量的动物和人体试验证明。鉴于此，构建稳定、高效、安全的痘苗病毒表达载体具有重要的意义。由于痘苗病毒基因组十分庞人，且其DNA不具有感染性，因而不能通过直接的基因剪切方法将外源目的基因导入痘苗病毒的基因组。利用携带目的基因的穿梭载体在感染痘苗病毒的细胞中与痘苗病毒进行同源重组成为获得重组痘苗的通用和主要方法。因此，痘苗病毒穿梭载体的构建是重组痘苗病毒制备的基础和关键点。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种能够同时且高效表达至少三种外源基因的重组痘苗病毒穿梭载体。本专利技术的另一目的是提供上述痘苗病毒穿梭载体在基因工程活病毒载体疫苗、多肽及亚单位疫苗制备及生物制药中的应用。为了实现本专利技术目的，本专利技术的一种痘苗病毒穿梭载体，其含有根据痘苗病毒胸苷激酶基因TK及其侧翼序列设计的同源重组臂TKL和TKR，在TKL和TKR之间存在有3个或3个以上的多克隆位点，每个多克隆位点的两端分别连有PE/L启动子和T5nT终止子，所述穿梭载体还含有大肠杆菌复制起始位点PUC ori和抗性筛选标记。前述的穿梭载体，其出发载体为pBluescipt Sfi。前述的穿梭载体，所述抗性筛选标记为氨苄青霉素抗性基因。前述的穿梭载体，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。上述痘苗病毒穿梭载体的制备方法，包括步骤1)根据痘苗病毒天坛株VTT(购自中国疾病预防控制中心病毒控制研究所)的胸苷激酶基因TK及其侧翼序列设计并合成同源重组臂TKL和TKR ；2)将合成后的TKL和TKR连接至载体pBluescipt Sf i中，将连接产物命名为pSTK 质粒；3)人工设计并合成痘苗病毒PE/L强效复合启动子序列、3个或3个以上MCS多克隆位点以及终止信号序列，组成3个或3个以上表达盒，连接至pSTK质粒中，即得痘苗病毒穿梭载体，命名为PSTKE。本专利技术还提供上述痘苗病毒穿梭载体在基因工程活病毒载体疫苗、多肽及亚单位疫苗制备及生物制药中的应用。本专利技术进一步提供利用上述痘苗病毒穿梭载体制备得到的基因工程活病毒载体疫苗、多肽及亚单位疫苗。痘苗病毒穿梭载体的元件涉及重组臂、启动子、终止信号、重组方式、报告基因、大肠杆菌复制子等多个方面，每一种元件的选择都与重组效率和表达效率息息相关。本专利技术提供的痘苗病毒穿梭载体PSTKE，以痘苗病毒严格复制非必需区TK基因作为重组臂，不但能最大限度的保留亲本毒株的复制能力和重组痘苗病毒的免疫效力，而且实现了对痘苗病毒的减毒，提高了安全性；选取痘苗病毒早、晚期强力复合启动子，不仅保证目的基因全程、 高效表达，还保留其早期启动活性，实现了目的基因表达的连惯性；含有三个或三个以上独立的外源基因表达盒，可以同时插入和表达至少三个目的基因，相互之间不受干扰和影响， 避免了使用不同载体的麻烦，更有利于多价疫苗的构建和不同外源基因的表达；所有表达盒内均添加痘病毒强效 复合启动子和转录终止信号T5nT(TTTTTNT)，能确保目的基因的高效转录和表达；采用同源重组方式构建重组痘苗病毒，避免直接操作庞大基因组的不便； 通过绿色荧光蛋白基因(EGFP)分别对三个表达盒进行了验证，结果表明三个表达盒均能够高效表达外源基因，表明穿梭载体构建成功。本专利技术的优点在于(1)本专利技术提供的痘苗病毒穿梭载体将胸苷激酶基因TK作为重组臂和筛选标记， 既达到筛选重组痘苗病毒的目的，又敲除了 TK基因，实现了减毒，提高了临床应用安全性；(2)本专利技术提供的痘苗病毒穿梭载体含有三个或三个以上外源基因表达盒，可同时且高效表达至少三种外源基因，可实现多基因表达的需要；(3)本专利技术提供的痘苗病毒穿梭载体采用具有早、晚期表达活性的强力复合启动子，解决了重组痘苗病毒目的基因表达弱、目的基因表达周期不连贯的问题。附图说明图1为本专利技术实施例1表达盒模式结构核苷酸序列图，其中含有三个独立的表达盒，每个表达盒均由复合强启动子序列(PE/L)、多克隆位点(MCS)及强转录终止序列 (Τ5ΝΤ)组成。图2为本专利技术实施例2痘苗病毒穿梭载体pSTKE示意图。图3A 图3D为本专利技术实施例3重组痘病毒在BHK本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种痘苗病毒穿梭载体，其特征在于，其含有根据痘苗病毒胸苷激酶基因ＴＫ及其侧翼序列设计的同源重组臂ＴＫＬ和ＴＫＲ，在ＴＫＬ和ＴＫＲ之间存在有３个或３个以上的多克隆位点，每个多克隆位点的两端分别连有ＰＥ／Ｌ启动子和Ｔ５ｎＴ终止子，所述穿梭载体还含有大肠杆菌复制起始位点ｐＵＣ　ｏｒｉ和抗性筛选标记。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：金宁一，李昌，李霄，杜寿文，鲁会军，田明尧，金扩世，王宇航，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所，
类型：发明
国别省市：82