一种虫草金属硫蛋白的生产方法技术

本发明专利技术公开了一种虫草金属硫蛋白的生产方法，其具体步骤为：虫草菌→液体培养(添加硫酸锌诱导)→菌丝体过滤→富含金属硫蛋白的菌丝体→加缓冲液、研磨破碎细胞→加有机变性、搅拌，杂蛋白变性→离心去除杂蛋白→清夜加热变性→离心去除变性蛋白→迅速冷却至室温→超滤浓缩→浓缩液→G-50层析→巯基试剂法监测收集MT洗脱液→MT洗脱液真空冷冻干燥→MT冻干粉，本发明专利技术操作简单，生产周期短，菌丝体或子实体中MT产率高，可以进行工厂化生产。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及，具体的说涉及一种诱导虫草属真菌大量产生金属硫蛋白，以虫草属真菌菌丝体为原料大量生产金属硫蛋白的方法。
技术介绍
1957年Margoshes和Vallee在马的肾脏里发现一种富含CcUZn的低分子量蛋白质，随后Kagl和Vallee将其提纯，并命名为金属硫蛋白(Metallothionein，MT)。MT广泛存在于生物界里，动物体内的MT主要在肝脏中合成，在血液、肾脏中存在。金属硫蛋白是一种分子量较小(6000 7000)、富含半胱氨酸的非酶蛋白质，其内含有Cd、Cu、Zn、Hg、Au等元素，不含芳香族氨基酸及组氨酸残基。具有以下特征分子量低；含30%半胱氨酸且无芳香族氨基酸；巯基与金属比例为3 1或2 1、4 1 ；金属含量高，每mol含6个金属原子。近年来研究发现，金属硫蛋白有许多生物功能，如可以清除体内自由基，其清除自由基的能力是SOD和谷胱甘肽(GSH)的10000倍；能解除重金属毒素，可以与铅、砷、汞等有毒金属紧密结合，解除重金属毒素，是目前临床最理想的生物解毒剂；能抗辐射和紫外线照射，MT含量丰富的细胞组织，可抵抗离辐射或紫外线引起的细胞组织损伤；能参与体内微量元素代谢，可根据体内微量元素状况，自动释放出金属离子，补充体内所缺元素，调节体内微量元素平衡，增强体质；还能防止细胞癌变，可消除自由基、重金属，从而防止它们致癌、致突变作用，可以帮助维持细胞正常代谢和分裂，激发人体免疫功能，增强肌体的防癌抗癌作用等。随着对金属硫蛋白结构、功能等研究的深入，其用途日益广泛，对其需求量越来越大。目前已有许多金属硫蛋白生产方法的报道，大部分生产方法是通过某种重金属诱导某种普遍饲养的动物(如家兔、猪等)产生MT，然后采用相应的理化技术从该动物脏器中分离纯化得到MT制品。这种诱导动物生产MT的方法有如下缺点饲养动物容易受到自然条件和规模的制约；动物来源的生化制品有传染疾病的潜在隐患。所以迄今为止一直缺乏一种高产量、低成本、安全性高、适宜于规模化生产MT的技术和方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服上述已有技术的不足而提供一种操作简单，生产周期短， 菌丝体或子实体中MT产率高，可以进行工厂化生产的虫草金属硫蛋白的生产方法。本专利技术可以通过虫草属真菌人工培养过程中添加一定量的硫酸锌，诱导虫草菌大量产生金属硫蛋白。工艺过程为虫草菌一液体培养(添加硫酸锌诱导)一菌丝体过滤一富含金属硫蛋白的菌丝体 —加缓冲液、研磨破碎细胞一加有机变性、搅拌，杂蛋白变性一离心去除杂蛋白一清夜加热变性一离心去除变性蛋白一迅速冷却至室温一超滤浓缩一浓缩液一G-50层析一巯基试剂法监测收集MT洗脱液一MT洗脱液真空冷冻干燥一MT冻干粉。本专利技术的目的可以通过如下措施来达到，其特征在于其具体步骤为(1)培养虫草属真菌菌丝体将虫草属真菌进行试管斜面菌种培养(活化)、三角瓶液体种子培养、种子罐培养及发酵罐培养，发酵罐培养步骤的培养基为每升培养液中葡萄糖10-50g，蛋白胨5-10g，酵母提取物l-10g，硫酸锌5-20g，pH值为5. 0-7. 0 ；发酵罐投料体积60%-80%，接种重量5-10%，温度20 30°C，通气1 0. 3 0. 8，搅拌转速80 150rpm，培养至菌丝体收得率大于等于1. 2 %，培养基还原糖含量小于等于0. 2 %时，放罐收获菌丝体；(2)板框过滤将培养好的虫草属真菌菌丝体以板框过滤机过滤，经过板框过滤后取出菌丝体，得到的菌丝体可以用于金属硫蛋白的提取；(3)研磨使细胞破碎，杂蛋白变性将上述菌丝体中加入相当于菌丝体重量1. 5 3倍的0. 05mol/LTris (三羟甲基氨基甲烷)-HC1，pH 8. 6，用研磨机研磨、勻浆，至细胞破碎后，加入与菌丝体和Tris (三羟甲基氨基甲烷)_HC1等重量的氯仿和乙醇，氯仿和乙醇的体积比为0.08 1，变性除杂蛋白，搅拌约5 IOmin ；将细胞破碎液于5000 lOOOOr/min离心，弃沉淀，得上清液；上清液80 90°C 热变性5-lOmin，沉淀杂蛋白，静置0. 5h以上，8000r/min以上离心弃沉淀，得上清液，为MT 的粗提液；粗提液以截留分子量小于2000的膜超滤浓缩，得浓缩液；(4)柱层析将上述的MT的提取液的浓缩液采用葡聚糖凝胶G-50进行柱层析分离，以去离子水洗脱，在254nm检测洗脱液的吸收峰，吸收峰部分辅助以巯基试剂法监测， 收集巯基试剂法监测到的最大吸收峰，即为金属硫蛋白部分；将柱层析得到的MT收集液冷冻干燥，得到虫草金属硫蛋白冻干粉。为了进一步实现本专利技术的目的，所述的试管斜面菌种培养(活化)步骤配制培养基每升培养液中葡萄糖5-25g，蛋白胨5-10g，酵母提取物l-10g，琼脂粉10-20g，调pH值为5. 0-7. 0，分装于试管中，灭菌，制成斜面；将虫草菌种在无菌条件下接入试管斜面，15 30 °C培养5-10天。为了进一步实现本专利技术的目的，所述的三角瓶液体种子培养步骤配制培养基 每升培养液中葡萄糖10_20g，蛋白胨5-10g，酵母提取物l-10g，pH值为5. 0-7. 0，将配制好的培养基分装入500ml锥形瓶中，每瓶装200ml，封口后在120 130°C条件下灭菌18 30 分钟，取出培养基，自然冷却至20 30°C ；在无菌条件下每瓶接入黄豆粒大小的斜面培养物1-2块，15 30°C，摇床转速120rpm，培养5天 10天。为了进一步实现本专利技术的目的，所述的种子罐培养步骤配制培养基每升培养液中葡萄糖10_20g，蛋白胨5-10g，酵母提取物l-10g，pH值为5. 0-7.0，投料体积 60 % -80 %，分批灭菌，接入培养好的三角瓶液体菌种，接种量2-10 %，培养温度15 30°C，通气1 0. 5，搅拌转速120rpm，在种子罐中15 30°C培养2-5天，至菌丝体收得率 0. 4-0. 8% (干计)。本专利技术同已有技术相比可产生如下积极效果和显著的进步申请人通过对虫草属真菌多年的基础研究，发现了虫草属真菌产生金属硫蛋白的高能力，可以解决金属硫蛋白产生源的问题。本专利技术生产周期短，金属硫蛋白产率高，生产成本低的优点。具体实施例方式下面对本专利技术的具体实施方式作详细说明实施例1 菌种蛹虫草(Cordyc印s militaris (L. ) Link)菌种来源于中国林业微生物菌种保藏管理中心，编号Cfcc 5974。试管斜面菌种培养(活化)配制培养基每升培养液中葡萄糖25g，蛋白胨5g，酵母提取物lg，琼脂粉15g， 调PH值为7. 0，分装于试管中，灭菌，制成斜面；将蛹虫草菌种在无菌条件下接入试管斜面， 25°C培养7天。三角瓶液体种子培养配制培养基每升培养液中葡萄糖20g，蛋白胨5g，酵母提取物lg，pH值为7.0， 将配制好的培养基分装入500ml锥形瓶中，每瓶装200ml，封口后在121°C条件下灭菌20 分钟，取出培养基，自然冷却至30°C ；在无菌条件下每瓶接入黄豆粒大小的斜面培养物1-2 块，30 0C，摇床转速120rpm，培养5天。种子罐培养配制培养基每升培养液中葡萄糖20g，蛋白胨5g，酵母提取物lg，pH值为7.0， 投料体积80%，分批灭菌，接入培养好的三角瓶本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种虫草金属硫蛋白的生产方法，其特征在于其具体步骤为：（１）培养虫草属真菌菌丝体：将虫草属真菌进行试管斜面菌种培养（活化）、三角瓶液体种子培养、种子罐培养及发酵罐培养，发酵罐培养步骤的培养基为：每升培养液中葡萄糖１０－５０ｇ，蛋白胨５－１０ｇ，酵母提取物１－１０ｇ，硫酸锌５－２０ｇ，ｐＨ值为５．０－７．０；发酵罐投料体积６０％－８０％，接种重量５－１０％，温度２０～３０℃，通气１∶０．３～０．８，搅拌转速８０～１５０ｒｐｍ，培养至菌丝体收得率大于等于１．２％，培养基还原糖含量小于等于０．２％时，放罐收获菌丝体；（２）板框过滤：将培养好的虫草属真菌菌丝体以板框过滤机过滤，经过板框过滤后取出菌丝体，得到的菌丝体可以用于金属硫蛋白的提取；（３）研磨使细胞破碎，杂蛋白变性：将上述菌丝体中加入相当于菌丝体重量１．５～３倍的０．０５ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ（三羟甲基氨基甲烷）－ＨＣｌ，ｐＨ　８．６，用研磨机研磨、匀浆，至细胞破碎后，加入与菌丝体和Ｔｒｉｓ（三羟甲基氨基甲烷）－ＨＣｌ等重量的氯仿和乙醇，氯仿和乙醇的体积比为０．０８∶１，变性除杂蛋白，搅拌约５～１０ｍｉｎ；将细胞破碎液于５０００～１００００ｒ／ｍｉｎ离心，弃沉淀，得上清液；上清液８０～９０℃热变性５－１０ｍｉｎ，沉淀杂蛋白，静置０．５ｈ以上，８０００ｒ／ｍｉｎ以上离心弃沉淀，得上清液，为ＭＴ的粗提液；粗提液以截留分子量小于２０００的膜超滤浓缩，得浓缩液；（４）柱层析：将上述的ＭＴ的提取液的浓缩液采用葡聚糖凝胶Ｇ－５０进行柱层析分离，以去离子水洗脱，在２５４ｎｍ检测洗脱液的吸收峰，吸收峰部分辅助以巯基试剂法监测，收集巯基试剂法监测到的最大吸收峰，即为金属硫蛋白部分；将柱层析得到的ＭＴ收集液冷冻干燥，得到虫草金属硫蛋白冻干粉。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：程显好，张聪聪，马天云，李维焕，董洪新，刘宇，
申请(专利权)人：鲁东大学，
类型：发明
国别省市：37