本发明专利技术提供了一种检测恩诺沙星的scFv抗体，其包括重链和轻链，重链和轻链之间由柔性连接肽(Gly4Ser)3连接。重链和轻链的氨基酸序列分别如SEQ?ID?No.1和2所示。本发明专利技术还提供编码上述scFv抗体的基因。本发明专利技术检测恩诺沙星的scFv抗体，主要采用竞争性Elisa方法定性或定量检测样品中恩诺沙星的残留量；对样品的前处理要求低，前处理过程简单，能同时快速检测大批样品；初次建库后，该种scFv抗体的制备便很方便，简单。采用高特异性的抗恩诺沙星scFv抗体，主要试剂以工作液的形式提供，检验方法方便易行，具有特异性好、灵敏度高、精确度高、准确度高等特点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及免疫学检测领域，具体地说，涉及一种检测恩诺沙星的SCFv重组抗体、其编码基因及应用。
技术介绍
恩诺沙星(Enrofloxacin，ENR0)，化学名称为1_环丙基_7-(4_乙基哌嗪基)-6-氟-1，4- 二氢-4-氧代-3-喹啉羧酸，属于氟奎诺酮类，具广谱抗菌活性，对支原体有特效，对大肠杆菌、克雷白杆菌、沙门氏菌、变形杆菌、绿脓杆菌、嗜血杆菌、多杀性巴氏杆菌、溶血性巴氏杆菌、金葡菌、链球菌等都有杀菌效用。恩诺沙星可作为动物用药品，在动物体内的半衰期长，有良好之组织分布性，属于广效性抑菌剂，对于革兰氏阳性菌、阴性菌及霉浆体具有抑菌作用。它作为一种常用兽药在畜牧业生产中得到广泛使用。但因其具有一定的毒性，在动物性食品中的残留对食品卫生和公共健康产生威胁。检测恩诺沙星残留的方法主要有仪器分析法和免疫学方法。化学分析方法因需要昂贵的仪器设备、对样品前处理要求高，且需要配备专门操作人员等，不适合现场监控检测。免疫学方法，目前主要是Elisa(酶联免疫吸附)方法，但该方法的核心试剂-单克隆抗体，因其制备和筛选过程繁琐，并对操作技术要求很高，故其广泛运用受到了很大限制。综上，本专利技术人提出了运用噬菌体展示技术制备抗恩诺沙星的scFv重组抗体，并以此建立检测恩诺沙星残留的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种检测恩诺沙星的scFv抗体及编码该抗体的基因序列及氨基酸序列。本专利技术的另一目的是提供上述scFv抗体及其编码基因在检测恩诺沙星中的应用。为了实现本专利技术目的，本专利技术人运用噬菌体展示技术，将小鼠抗体的重链、轻链可变区基因进行体外扩增，并借助了 15肽的连接肽段将重链和轻链片段拼接成一条单链抗体scFv，接着将该scFv片段插入噬菌体展示载体pCANTABk中，构建成重组质粒，并转化进宿主菌中，经过3轮固相淘筛和鉴定，获得了抗恩诺沙星的scFv单链抗体。其包括重链和轻链，其中，重链和轻链的氨基酸序列分别如SEQ IDNo. 1和SEQ ID No. 2所示。前述的scFv抗体，重链和轻链之间的连接肽段为(GlyJer) 3。本专利技术还提供编码上述scFv抗体的基因，其中，编码scFv抗体重链的基因具有 SEQ ID No. 3所示的核苷酸序列，编码scFv抗体轻链的基因具有SEQ ID No. 4所示的核苷酸序列。本专利技术还提供含有编码上述SCFv抗体的基因的载体。本专利技术还提供含有上述载体的宿主细胞。3本专利技术进一步提供上述scFv抗体、编码该抗体的基因、含有所述基因的载体或含有该载体的宿主细胞在检测恩诺沙星中的应用。本专利技术还提供上述scFv抗体的制备方法，其是将编码上述scFv抗体的基因构建至表达载体中并转化宿主细胞，然后进行蛋白的表达及分离纯化。其中，所述表达载体为 pCANTAB5e。借由上述技术方案，本专利技术至少具有下列优点及有益效果本专利技术检测恩诺沙星的scFv抗体，主要采用竞争性Elisa方法定性或定量检测样品中恩诺沙星的残留量；对样品的前处理要求低，样品前处理过程简单，能同时快速检测大批样品；采用高特异性的恩诺沙星scFv抗体，主要试剂以工作液的形式提供，检验方法方便易行，具有特异性高、灵敏度高、精确度高、准确度高等特点。本专利技术的方法高效、准确、简便、适于大批量样品筛选的定性、定量检测。能简便、高效地运用本专利技术获得的能分泌表达抗恩诺沙星重组抗体的重组菌株制备特异性的抗恩诺沙星scFv重组抗体。附图说明图IA和图IB :scFv-pCANTAB5e重组质粒sfil和NotI双酶切电泳图，M :DL2000 核酸分子量Marker，1 20 :scFv-pCANTAB5e酶切产物。图2 为30个重组菌诱导表达产生可溶性抗体scFv-ELISA检测结果。图3 重组菌诱导表达产物SDS-PAGE电泳图，1 阴性对照，2 重组菌诱导表达胞周间质，3 重组菌诱导表达上清液，4 重组菌诱导表达全细胞提取物。图4 恩诺沙星诱导表达上清可溶性重组抗体IC5tl实验结果曲线图。具体实施例方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。以下实施例中使用的试剂盒材料均为市售商品。实施例1免疫原及检测原的偶联制备1、材料牛血清白蛋白(BSA)、卵清白蛋白(OVA)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、1-乙基-(3-二甲基丙基)碳化二亚胺(EDC)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、恩诺沙星(ENRO)标准品、透析膜、透析膜处理液、磁力搅拌仪、紫外分光光度仪。2、方法采用混合酸酐法，将恩诺沙星与蛋白大分子(BSA、OVA)进行偶联，制备免疫原和包被原。2. 1免疫原及包被原合成及纯化A.中间产物制备a.取20mg药物置于烧杯中，加入^iil DMF，若溶解不充分，可在超声波中助溶；b.充分溶解后，加入25mg EDC和20mg NHS,磁力搅拌反应；c.将以上烧杯用锡箔纸包裹好，室温磁力搅拌反应M小时，此液为A液。B.合成及初步纯化a.取 50mg BSA (或 OVA)溶于 6ml PBS (0. 01M, ρΗ7· 4)中，充分溶解，此液为 B 液；b.在磁力搅拌下，将A液逐滴滴入B液中；c.用锡箔纸将烧杯包裹，室温搅拌反应过夜；d.待以上反应完成，将过夜反应液转移至处理好的透析袋中，于4°C冰箱中，用 PBS透析3天。透析中，前3次，每隔2小时换液，之后每8-12小时换液；e.透析结束后，将透析袋内的溶液以4000rpm离心30min，取上清，_20°C冻存；f.取透析液在紫外分光光度仪下，检测偶联效果及偶联物浓度测定表明 ENRO-BSA, ENRO-OVA偶联物制备成功。实施例2小鼠免疫1、材料Balb/c小鼠(雄性、6周龄)、弗氏完全佐剂(sigma公司)、弗氏不完全佐剂(sigma 公司)、96孔酶标板、免疫原ENR0-BSA、包被原ENRO-OVA、包被缓冲液(Na2CO3缓冲液0. 05N, ρΗ9· 6)、封闭液(2%脱脂乳PBS)、洗涤缓冲液(PBS、0. 1% Tween20 PBST)、终止液、鼠源抗恩诺沙星单克隆抗体、HRP标记山羊抗鼠IgG抗体(sigma公司)、TMB显色液(sigma公司)。2、方法2.1小鼠免疫a.取100 μ g免疫原ENRO-BSA加入等量弗氏完全佐剂，制成乳化剂；b.首免取8只6周龄Balb/c小鼠，采用背部多点注射免疫，0. 2ml/只，同时设置生理盐水对照组；c. 二免与三免免疫方法取100 μ g免疫原与等量弗氏不完全佐剂制成乳化剂， 背部多点免疫小鼠；每次免疫间隔15天。d.三免15天后，处死小鼠，摘取脾脏，_70°C冻存。眶下窦取血，离心取血清。2. 2ELISA检测免疫小鼠血清抗体效价a.将包被原 ENRO-OVA 用包被缓冲液，按照 0. 5mg/l、0. 4mg/l,0. 3mg/l,0. 2mg/l, 0. lmg/1浓度梯度，200 μ 1/孔，包被酶标板，4°C包被过夜；b.洗涤弃包被液，用PBS洗涤3次，拍干酶标板；c.封闭向每孔加满封闭液，于37 °C封闭1. 5小时；d.洗涤弃封闭液，用PBS洗涤3次，拍干酶标板；e.加血清抗体将小鼠血清抗体，用PBS按照1 IOOU 200,1 400,1 800、 1 1600、本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种检测恩诺沙星的ｓｃＦｖ抗体，其包括重链和轻链，其特征在于，重链和轻链的氨基酸序列分别如ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１和ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２所示，重链和轻链之间由连接肽段连接。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：郑志明，侯晓林，金社胜，刘文娟，赵扬，
申请(专利权)人：商务部流通产业促进中心，
类型：发明
国别省市：11
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