一种利用RNA恒温扩增的解脲脲原体核酸检测试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及一种利用RNA恒温扩增的解脲脲原体核酸检测试剂盒，包括：尿样保存液；核酸提取液；UU反应液；UU检测液；SAT酶液；UU阳性对照；UU阴性对照。本发明专利技术的检测试剂盒检测UU菌的分析灵敏度为50CFU/反应，特异性高、灵敏度高，且扩增产物RNA在自然环境下易于降解而污染低。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属体外诊断试剂
，特别是涉及一种利用RNA恒温扩增的解脲脲原体核酸检测试剂盒。
技术介绍
解脲脲原体⑴reaplasma urealyticum, UU)是一类原核细胞微生物，体积介于细菌与病毒之间，是人类泌尿生殖道的常见病原体，与许多泌尿生殖道感染症、围产期感染和不育症都有关系，是性传播疾病的病原体之一。值得注意的是，在孕妇中解脲脲原体感染者较多，国外有报道为80%，而我国有报道为55. 12%。在这个时期感染解脲脲原体，不仅危害母体健康，而且危害胎儿生存，很容易发生低体重儿、新生呼吸道感染、中枢神经系统感染、胎儿死亡等严重后果。解脲脲原体感染后，患者大多无明显症状，很难被患者觉察，也易造成医生漏诊， 因此实验室检测是临床诊断的重要辅助手段。目前，解脲脲原体的实验室检测方法主要有细胞生物学检测方法(如培养和镜检)、免疫学检测方法(如抗原检测法)和分子生物学方法(如PCR和实时荧光定量PCR法)。然而细胞生物学法耗时费力，操作技术高；免疫学检测方法(如抗原检测法)特异性差，灵敏度低，都不利于早期的临床快速、特异诊断。分子生物学方法主要为PCR法。PCR属于一种核酸体外扩增技术，用寡核苷酸指导的DNA合成的重复循环来实现对靶核酸序列的扩增。PCR技术不但能检测尿道或宫颈拭子标本，而且可以采用尿标本进行检测。但尿中可能存在扩增的抑制物，从而影响PCR的敏感性。除了尿中的抑制物会影响PCR的敏感性，导致出现假阴性结果外，PCR的另外一个缺点是容易造成假阳性污染，并且对用药后康复的病人检测结果仍出现阳性结果。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种利用RNA恒温扩增的解脲脲原体核酸检测试剂盒，该检测试剂盒检测UU菌的分析灵敏度为50CFU/反应，特异性高、灵敏度高，且扩增产物RNA在自然环境下易于降解而污染低。本专利技术的一种利用RNA恒温扩增的解脲脲原体核酸检测试剂盒，包括(1)尿样保存液含有硫酸铵和去垢剂；(2)核酸提取液含有磁性颗粒和捕获探针；(3) UU反应液含dNIPs和NIPs扩增所需组份；(4) UU检测液为恒温扩增时必需的UU引物和UU荧光探针溶解在TE溶液 (IOmMTris和ImM EDTA的混合液)中配制而成；其中UU检测液中的引物包含有以下一对或几对序列UU T7 序列见序列表SEQ. ID. N03-6 ；UU nT7 序列见序列表SEQ. ID. N07-10 ；UU 检测液中的探针包含有以下一种或几种序列UU probe 序列见序列表SEQ. ID. N011-12 ；(5)SAT酶液为恒温扩增时的多酶组分体系，含T7 RNA聚合酶200 2000U/ 反应、M-MLV 反转录酶 400 4000U/ 反应、2 IOmM HEPES ρΗ7. 5、10 IOOmMN-acetyl-L-cysteine>0. 04 0. 4mM zinc acetate、10 IOOmM trehalose、40 200mM Tris-HCl pH 8. 0、40 200mMKCl、1 IOmM EDTA、2 20% (v/v) Triton X_100、10 40% (v/v)glycerol ；(6)UU阳性对照为失活的UU菌，浓度为2X 105CFU/ml ；(7)UU阴性对照为不含有SEQ. ID. N013核酸序列或不含有解脲脲原体的溶液。所述的试剂盒还包括洗涤液。所述的洗涤液为含十二烷基磺酸钠(SDS)、NaCl和乙醇的溶液，具体包含SDS 0. 1 1 %，NaCl 10 150mM，乙醇 0. 1 1 %。尿样保存液主要有效成分是硫酸铵和去垢剂，高浓度去垢剂的存在能够使RNase 迅速失活，有效保存RNA。另外，尿样保存液中高浓度盐离子及去垢剂的存在，通过蛋白质变性使菌体细胞破裂，靶标RNA得到了释放，样本放在该保存液中，延长了样本的保存时间， RNA从细胞中释放出来。尿样保存液为裂解和保存尿液或生殖道拭子洗涤液标本中解脲脲原体(UU)RNA 的表面活性剂和4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPEQ缓冲液，具体包括0. 1 IOM硫酸铵； 0.15 1MHEPES。核酸提取液是利用了磁珠分离法进行核酸提取，其主要成分为磁性颗粒和捕获探针。在核酸提取过程中，细菌裂解释放出的核酸与核酸提取液中的磁性颗粒特异结合，在不需要传统的离心操作的情况下，通过清洗磁性颗粒而获得纯净的支原体靶标核酸(RNA)。病原体rRNA的提取通过特异性吸附原理来实现。核酸提取液为捕获核酸时必须的一个组分，具体包含磁珠0. 1 10mg/ml， TC00. 1 100 μ M0核酸提取液中含有的标本提取捕获探针，包含有以下一种或几种序列序列见序列表 SEQ. ID. N01-2。UU 反应液具体包含 Tris 10 50mM，MgCl2 10 40mM，dNTP 0. 5 5mM，NTP 1 IOmM, PVP40 1 10%，KCl 5 40mM。SAT酶液中所含的T7 RNA聚合酶、M-MLV反转录酶，其稳定性直接决定了扩增反应的扩增效率和试剂盒的使用有效期。该SAT酶液中加有稳定剂，经长期稳定性试验，稳定性可达10个月，保证了试剂盒有效期达6个月。UU检测液中UU荧光探针为分子信标，是一类高特异性、高敏感性的分子探针，由两端分别共价标记有荧光染料和淬灭剂的单链核酸分子组成，呈发夹型或茎环结构，分子信标的环部分和靶标互补，两头由于互补而成为茎，分子信标探针与线性的TaqMan探针相比，因其发夹结构的打开需要一定的力，因而特异性要好于线性探针。UU检测液中UU引物， 依照SAT扩增的原理设计了 5’端带有T7启动子序列尾巴的下游引物和特异的上游引物， 下游引物特异序列与靶标完全互补，上游引物与靶标完全一致，保证了本试剂盒可准确进行UU检测的SAT反应。所述步骤(4)中的引物探针序列选自长1197bp UU 16S rRNA基因，序列见序列表 SEQ. ID. N013。由于UU是一个条件致病菌，临床中检测UU需浓度彡104CFU/ml，才认为与炎症关系较大。结合本试剂盒要求的操作方法，本专利技术中阳性对照为灭活的UU菌，浓度设定为2X105CFU/ml，最终通过换算，相当于临床上104CFU/ml。因此，本专利技术中阳性对照具有界值参考品的功能，可用于UU检测的相对定量。由于SAT扩增易受多种因素影响而使扩增失败，使试剂盒使用人员判断失误得出错误的结论，本专利技术的试剂盒中的UU阳性对照和UU阴性对照，均含有本试剂盒已述及的尿样保存液及生理盐水。使用本试剂盒时，每次应同时做平行对照的质量控制，且结果应同时满足阳性对照dt < 35，阴性对照dt无数值或为40，否则此次实验视为无效。(dt表示样本曲线与阈值线交点的横坐标读数，与一般实时荧光PCR实验结果的ct值类似。)在专利核酸恒温同步放大检测方法(Simultaneous Amplification and Testing, SAT)(申请号200810111479. 0)以及利用磁珠-RNA富集技术提取纯化靶标RNA 的方法(申请号200810111478.6)的基础上，本专利技术解脲脲原体(UU)本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种利用ＲＮＡ恒温扩增的解脲脲原体核酸检测试剂盒，包括：（１）尿样保存液：含有硫酸铵和去垢剂；（２）核酸提取液：含有磁性颗粒和捕获探针；（３）ＵＵ反应液：含ｄＮＴＰｓ和ＮＴＰｓ扩增所需组份；（４）ＵＵ检测液：为恒温扩增时必需的ＵＵ引物和ＵＵ荧光探针溶解在ＴＥ溶液中配制而成；其中ＵＵ检测液中的引物包含有以下一对或几对序列：ＵＵ　Ｔ７：ａａｔｔｔａａｔａｃ　ｇａｃｔｃａｃｔａｔ　ａｇｇｇａｇａｃｔａ　ｃｔａｃａｃｔｃｔａ　ｇｇｔｔｔａｃａｇｔ　ｔｔ；　　　　　　　ａａｔｔｔａａｔａｃ　ｇａｃｔｃａｃｔａｔ　ａｇｇｇａｇａｃｃｔ　ａｃｔａｃａｃｔｃｔ　ａｇｇｔｔｔａｃａｇ；　　　　　　　ａａｔｔｔａａｔａｃ　ｇａｃｔｃａｃｔａｔ　ａｇｇｇａｇａａｇｃ　ｇｔｃｇｃａａｔａｇ　ａｔｇｔｃａａａｃｃ；　　　　　　　ａａｔｔｔａａｔａｃ　ｇａｃｔｃａｃｔａｔ　ａｇｇｇａｇａａｇｃ　ｇｔｃｇｃａａｔａｇ　ａｔｇｔｃａａａｃｃ　ｔａｇ；ＵＵ　ｎＴ７：ａｇｃｃｇｃｇｇｔａ　ａｔａｃａｔａｇｇａ　ｔｇｃａａｇ；　　　　　　　　ａｇｃｃｇｃｇｇｔａ　ａｔａｃａｔａｇｇａ　ｔｇ；　　　　　　　　ａｇｔａｇｔｃｃａｃ　ａｃｃｇｔａａａｃｇ　ａ；　　　　　　　　ｔａｇｔａｇｔｃｃａ　ｃａｃｃｇｔａａａｃ　ｇａｔｃａｔｃａ；ＵＵ检测液中的探针包含有以下一种或几种序列：ＵＵ　ｐｒｏｂｅ：ｃｃｇａｇｃｇｇｔｇ　ｔｔｇｔａｇｃｔａａ　ｃｔｃｇｇ；　　　　　　　　　　ｃｃｇａｇｔｃｔａｇ　ａｔｇｃｔｔａａｃｇ　ｔｃｔｃｇｇ；（５）ＳＡＴ酶液：为恒温扩增时的多酶组分体系，含Ｔ７　ＲＮＡ聚合酶２００～２０００Ｕ／反应、Ｍ－ＭＬＶ反转录酶４００～４０００Ｕ／反应、２～１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　ｐＨ７．５、１０～１００ｍＭ　Ｎ－ａｃｅｔｙｌ－Ｌ－ｃｙｓｔｅｉｎｅ、０．０４～０．４ｍＭ　ｚｉｎｃ　ａｃｅｔａｔｅ、１０～１００ｍＭ　ｔｒｅｈａｌｏｓｅ、４０～２００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　ｐＨ　８．０、４０～２００ｍＭＫＣｌ、１～１０ｍＭ　ＥＤＴＡ、２～２０％ｖ／ｖ　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００、１０～４０％ｖ／ｖ　ｇｌｙｃｅｒｏｌ；（６）ＵＵ阳性对照：为失活的ＵＵ菌，浓度为２×１０５ＣＦＵ／ｍｌ；（７）ＵＵ阴性对照：为不含有ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ１３核酸序列或不含有解脲脲原体的溶液。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：于明辉，方亮，张常娥，居金良，
申请(专利权)人：上海仁度生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：31