本发明专利技术公开了快速定量检测西瓜果斑病菌的蛋白芯片及其制备使用方法。本发明专利技术提供的快速定量检测西瓜果斑病菌的蛋白芯片，是在芯片基片上固定至少一种西瓜果斑病菌捕获抗体的生物芯片。以硝酸纤维素膜为芯片载体，利用特异性抗体捕获西瓜果斑病菌，同时以碱性磷酸酶标记的IgG作为阳性对照、点样缓冲液作为阴性对照，检测结果既可用肉眼直接判定，也可通过灰度分析作定量检测。相对传统ELISA，本发明专利技术以1/12的捕获抗体用量，1/8的检测时间，达到与ELISA同等的检测能力；并且本发明专利技术操作简便，检测结果可长期保存，可用于种植一线对西瓜果斑病菌的快速自检，推广前景广阔。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及植物保护领域，主要是针对西瓜果斑病菌(Acidovorax avenae subsp. citrulli (Schaad) Willems et al. 1992，Aac)快速定量检测的蛋白芯片。
技术介绍
西瓜果斑病(Bacterial fruit blotch of watermelon)是严重危害西瓜、甜瓜等葫芦科植物生产的病害。西瓜果斑病菌学名燕麦噬酸菌西瓜亚种，是引起果斑病的特异性病原，该病菌是植物保护领域一种重要的检疫性病害。西瓜果斑病最早于1965年由狗油和Goth首先报道，但一直未引起重视，直至 1989年，该病害在美国佛罗里达州、印第安纳州等地区普遍发生，使发病区高达80%的西瓜不能上市销售，导致当地西瓜经济损失惨重，才引起人们对该病的高度重视。我国自1986 年开始，就不断有疑似西瓜果斑病爆发的报道，但一直没有确定的病原菌鉴定报告，直到 1998年，张荣意对海南乐东、东方两县采集的3个菌株进行鉴定，首次确认了西瓜果斑病菌。近些年，该病在我国新疆、内蒙古等哈密瓜、西瓜的主产地发病严重，记录发病率最高达 70%-90%，给当地果农造成巨大损失。西瓜果斑病菌在分类学上属假单胞菌科噬酸菌属，西瓜感染该菌后，主要在子叶、 真叶和果实期发病。西瓜子叶感染该病后，先出现暗棕色病斑，并沿主脉逐渐发展为黑褐色坏死斑。病菌侵染真叶后，形成周围有黄色晕圈的暗棕色病斑。植株生长中期，病征通常不显著，当田间湿度较大时，沿叶脉可观察到水浸状的斑点，病叶很少脱落。果实期，开花后 2-3周的果实最容易感染，果实染病后，首先在果皮上出现几毫米大小的水渍状病斑，随后迅速扩展成几厘米的橄榄色大型斑块，斑块边缘不规则，并不断扩展，一周左右便可布满接触地面的整个果实表面。该病发病初期病变只限于果皮，内部果肉组织依然正常。发病中期后，病菌蔓延到果肉，使果肉呈水渍状。发病后期，由于早期在果皮形成的病斑老化导致表皮龟裂，使果实因同时感染杂菌而迅速腐烂。西瓜果斑病菌可在种子和土壤表面的病残体上越冬，进而成为来年的初浸染源。病害主要依靠带菌种子进行远距离传播。带菌种子萌发后病菌又可感染子叶和真叶，引起幼苗发病。故而，在种子进出口贸易中，及时发现和清除带菌种子，对遏制病害的传播显得尤为重要。目前，对西瓜果斑病菌的检测主要有种子培养、分离培养、ELISA和基于PCR技术的分子生物学方法(Direct-PCR、免疫-PCR、Bio-PCR等)。种子培养法需在温室中进行，全过程约需3周时间，耗时费力且易漏检无明显病征的带菌种子。分离培养和ELISA法也都具有与种子培养法类似的缺陷。基于PCR的分子生物学方法可比较快速的检测病菌，但检测结果易受种子成分的抑制而出现假阴性结果。蛋白芯片是近些年新发展起来的一项新技术，主要是利用抗原/抗体等可特异性结合的原理制备而成。蛋白芯片诞生初期主要被用于蛋白质组学研究，随后被逐渐推广至生物医学相关领域，而将蛋白芯片用于植物病原的快速检测，国内外目前仍未见相关报道。蛋白芯片用于植物病原的快速检测，具有节约时间、节省抗体、灵敏度高、重复性好等众多优点，检测结果既可用肉眼直接判定，也可通过分析灰度后作定量检测，应用前景极其广泛。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术的缺陷与不足，提供一种可快速定量检测西瓜果斑病菌的蛋白芯片方法。本专利技术可有效弥补现行植物病原检测方法普遍存在的周期长、不能作定量检测的缺点，为西瓜果斑病菌的定量检测提供一种快速、灵敏、经济的新方法，为植物病原检测开创一种新思路。本专利技术还提供了一种快速定量检测西瓜果斑病菌的蛋白芯片的制备方法和检测方法。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为一种快速定量检测西瓜果斑病菌的蛋白芯片，其主要特点在于是在芯片基片上固定至少一种西瓜果斑病菌捕获抗体的生物 芯片。所述的快速定量检测西瓜果斑病菌的蛋白芯片，所述基片上还固定有酶标记的 IgG抗体作为阳性对照、点样缓冲液作为阴性对照；所述基片为硝酸纤维素膜(NC)。所述的快速定量检测西瓜果斑病菌的蛋白芯片，所述酶标记的IgG是碱性磷酸酶标记的IgG或辣根过氧化物酶标记的IgG，作为蛋白芯片质量控制的阳性对照固定于芯片基上ο一种快速定量检测西瓜果斑病菌的蛋白芯片的制备方法，其主要特点在于包括以下步骤a.基片预处理基片使用前需以ddH20浸泡，并晾干恒定；所述的浸泡时间至少 15min，优选30min ；所述的晾干温度为15-37° C，优选25° C ；b.芯片的点样制备以点样缓冲液稀释捕获抗体，同时取酶标记的IgG和点样缓冲液分别作为阳性对照，阴性对照，点样并固定；所述的点样缓冲液为0. 001-0. 5mol/L、pH值为7. 0-10. 0的碳酸盐缓冲液，优选0. 05 mol/L, pH为9. 6的碳酸盐缓冲液，碳酸盐缓冲液为 Na2CO3 1. 59 g, NaHCO3 2. 93 g, NaN3 0. 2 g, ddH20 1000 mL ；所述的捕获抗体浓度为 20-80mg/L，优选80 mg/L ；所述的点样体积为0. 01-0. !3uL，优选0. 2 uL ；所述的固定条件为 15-37° C，干燥固定 15-60min，优选 37° C，20min。一种快速定量检测西瓜果斑病菌的蛋白芯片的检测方法，其主要特点在于包括以下步骤(1)绘制定量标准曲线液体培养西瓜果斑病菌，无菌CldH2O梯度稀释后，以平板计数法获取菌悬液浓度；将梯度菌悬液分别与蛋白芯片杂交，洗涤液洗涤后，加入检测抗体反应，再与相应显色底物反应，最后以ddH20洗涤终止显色；平板扫描仪获取芯片结果进行灰度分析，利用阳性对照点灰度值校正各芯片检测信号，绘制检测信号灰度值与菌液浓度间的散点图，拟合线性方程，得到定量测定标准曲线；(2)检测实际样品将待检植物样品研磨后与提取缓冲液配制样品液，蛋白芯片孵育杂交，再与检测抗体、相应显色底物分别反应，利用肉眼判定或扫描仪扫描分析灰度，将检测灰度值带入标准曲线方程，便可定量得出样品中目标菌量。所述的快速定量检测西瓜果斑病菌的蛋白芯片的检测方法，所述步骤(1)中检测抗体的稀释液为含0. 01-2. 0% BSA和0. 01-2. 0%吐温-20的磷酸盐缓冲液，优选含0. 2% BSA和0. 05%吐温-20的磷酸盐缓冲液；所述洗涤液为含0. 01-2. 0%吐温-20的磷酸盐缓冲液，优选含0. 05%吐温-20的磷酸盐缓冲液；所述显色底物为，与碱性磷酸酶相对应的 5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐/四唑硝基蓝(BCIP/NBT)显色底物。所述步骤(1)中的本专利技术提供的西瓜果斑病菌蛋白芯片检测方法，主要原理是将可特异性结合西瓜果斑病菌的捕获抗体按阵列排布固定于芯片基片表面，芯片与样品液孵育杂交后，样品中的西瓜果斑病菌被芯片表面的特异性抗体捕获结合，进一步与酶标记的检测抗体反应，芯片表面将形成特异性的捕获抗体-病原菌-检测抗体的复合体，最后检测抗体标记物相应的显色底物反应，芯片表面便呈现特定的检测信号。所述的快速定量检测西瓜果斑病菌的蛋白芯片的试剂盒，其主要特点在于包括有权利要求1至3所述的蛋白芯片；还包括有检测抗体原液，抗体稀释液，洗涤液和显色试剂所述抗体稀释液为含0. 01-2. 本文档来自技高网...
【技术保护点】
１． 一种快速定量检测西瓜果斑病菌的蛋白芯片，其特征在于：是在芯片基片上固定至少一种西瓜果斑病菌捕获抗体的生物芯片。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘箐，熊亮斌，孔君，
申请(专利权)人：上海慧耘生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：31
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