本发明专利技术公开了转基因玉米MON88017转化事件外源插入载体旁侧基因，其序列如序列表中1所示。本发明专利技术的转基因玉米MON88017转化事件外源插入载体旁侧基因可以用于特异性定性检测转基因玉米及相关产品是否含有MON88017转化事件以及其含量，该检测方法灵敏，准确，简单，可靠，具有广阔的市场前景。本发明专利技术首次分析并确认了转基因玉米Mon88017转化事件外源插入载体旁侧序列中不同碱基的来源，并确定外源插入载体序列和玉米基因组序列的接合位点，为科学研究做出了贡献。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及转基因玉米M0N88017转化事件外源插入载体旁侧基因及其应用。
技术介绍
近年来，玉米、大豆、棉花、油菜和番茄等转基因作物已在很多国家获得批准种植和生产，有的被加工成食品、饲料或用做食物添加剂。由于转基因产品的生态安全和食用安全一直备受争议，40多个国家和地区相继实施转基因产品标识制度。各国转基因标识制度的相继建立，对转基因检测技术的灵敏度和准确性提出了严格的要求，各种转基因检测技术也成为研究热点。常用的转基因检测方法有聚合酶链式反应(PCR)法，外源蛋白检测法，基因芯片检测技术。虽然国外对转基因作物检测方法研究已有十几年，但由于转基因作物的种类多、数量大，一些转基因产品经过深加工、各种条件处理与保存后，转基因成分部分或完全降解，所以检测难度大。因此，需要根据科学技术的发展不断更新检测方法。根据不同转基因植物及其产品检测目的的不同，鉴定转基因植物主要包括检测筛选基因、目的基因、不同基因间的交联结构基因、和转入基因与受体植物间的转化体特异结构基因。简介如下1.筛选型特异性检测方法筛选检测通常是检测转基因植物中CaMV35S启动子和NOS终止子，因为外源基因在转入作物中为了加强其表达通常会携带35S启动子和NOS终止子。但是35S启动子存在天然的花椰菜花叶病毒，NOS终止子存在于植物病毒Ti质粒中，抗生素类报告基因自然界中也普遍存在，因而仅是检测转基因植物的筛选基因，极易出现假阳性的结果，同时也达不到鉴定转基因植物的目的。2.基因特异性检测方法基因特异性检测就是检测转入转基因植物中的外源目的基因。目前人们检测的目的基因如CP4-EPSPS，BAR, CrylA(b)基因，但是由于一种作物中可能转入了几种目的基因或一种目的基因已转入到几种作物中，在检测时很容易出现假阴性。3.构建特异性检测方法构建特异性检测芯片是利用基因元件之间的边界序列特征，能够有效鉴定使用类似基因元件的不同构建体，而且存在序列信息容易获得的特点，因此被很多研究者所使用。 但是，由同一个构建体可能获得不止一个不同特性的转化株，甚至可能被转化到不同的物种中，而这些转化株未必全部经过了安全评估。因此构建特异性检测芯片检测方法不能识别不同的转基因品系，检测结果也很容易出现假阳性，也不能判断该转基因品系是否经过了安全评估。4.转化体特异性检测方法转化体特异性检测芯片的基础是转基因构建体在基因组DNA序列上的整合位点具有高度特异性，即使是相同的载体多次转化，整合的位置和整合位点特征也是不可能重复的。与前三种方法相比，转化体特异性检测具有最高的特异性，最适合做转基因产品的定性和定量检测。经对现有专利和其他文献的检索，尚未发现任何关于转基因玉米Mon88017外源插入旁侧序列和利用此序列建立转化体特异性定性、定量PCR检测的报道。
技术实现思路
针对上述现有技术，本专利技术的目的在于克服现有技术在检测转基因玉米Mon88017 中存在的不足，提供了一种转基因玉米Mon88017外源插入载体旁侧基因，及其应用。本专利技术是通过以下技术方案实现的转基因玉米M0N88017转化事件外源插入载体旁侧基因，其序列如序列表中1所示，总长504bp (顺序5' 3')，具体如下:aaattttgtc ctgaacccct aaaatcccaggaccgccacctatcatatacatacatgatc60ttctaaatac ccgatcagag cgctaagcagcagaatcgtgtgacaacgctagcagctctc120ctccaacaca tcatcgacaa gcaccttttttgccggagtatgacggtgacgatatattca180attgtaaatg gcttcatgtc cgggaaatctacatggatcagcaatgagtatggtggtcaa240tatggagaaa aagaaagagt aattaccaattttttttcaattcaaaaatgtagatgtccg300cagcgttatt ataaaatgaa agtacattttgataaaacgacaaattacgatccgtcgtat360ttataggcga aagcaataaa caaattattctaattcggaaatctttatttcgacgtgtct420acattcacgt ccaaatgggg gcttagatgagaaacttcacgatttggcgcgccaaagctt480actcgaggtc attcatatgc ttga504 ο所述转基因玉米M0N88017转化事件外源插入载体旁侧基因具有以下特征(1)从5'端开始前168bp为玉米基因组序列；(2)从第169bp至3'末端为插入到玉米中的载体序列，其中从第169bp 479bp 为间插序列，从第480bp至3'末端为水稻中P-ractl部分序列，P-ractl是actinl基因启动子，驱动cp4 epsps基因表达；(3)由来源于玉米基因组的第1至168个碱基和来源于外源插入载体的第169碱基至第504个碱基共同组成转基因玉米Mon88017转化事件外源插入载体旁侧基因序列。所述的转基因玉米M0N88017转化事件外源插入载体旁侧基因的提取方法，步骤如下(1)提取并纯化转基因玉米Mon88017基因组总DNA 采用Dra I,EcoR V,Pvu II、 Stu I四种限制性内切酶进行充分酶切，并对酶切产物进行纯化；(2)引物设计利用BD Genomeffalker试剂盒(美国Clontech公司生产)提供的接头引物APl和AP2，其序列分别为APl 5' -GTAATACGACTCACTATAGGGC-3‘；AP2 5' -ACTATAGGGCACGCGTGGT-3‘；另外，参照Mon88017插入载体结构序列设计引物如下P-ractgspl 5' -CTTTAGGACTTTAGGGGTTGTT-3‘；P-ractgsp2 5' -GGACTATCCCGACTCTCTTC-3‘；(3)以转基因玉米M0N88017基因组酶切产物为模板进行两轮PCR扩增引物对 APl 和 P-ractgspl 用于第一轮PCR 反应，扩增体系 20 μ L，PCR程序为 94°C 25s，72°C 3min，6 个循环;94°〇258，641308，36个循环；64°C延伸7min，1个循环；引物对AP2和P_ractgsp2 用于第二轮PCR，在第二轮PCR中用IyL第一轮扩增产物的50倍稀释液作为模板，PCR扩增体系和反应程序与第一轮PCR相同；第二轮PCR产物即为转基因玉米M0N88017转化事件外源插入载体旁侧基因；(4)将第二轮PCR产物纯化并克隆到TA载体上进行测序，得到转基因玉米 M0N88017转化事件外源插入载体旁侧基因。所述的转基因玉米M0N88017转化事件外源插入载体旁侧基因可以用于特异性定性检测玉米及相关产品是否含有M0N88017转化事件，具体应用时，方法如下(1)首先，根据转基因玉米M0N88017转化事件外源插入载体旁侧基因的序列设计引物，引物序列如下Mon88017-F 5' -TCCTGAACCCCTAAAATCCC-3‘；Mon88017-R 5'本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．转基因玉米ＭＯＮ８８０１７转化事件外源插入载体旁侧基因，其特征在于：其序列如序列表中１所示，具体如下：ａａａｔｔｔｔｇｔｃ ｃｔｇａａｃｃｃｃｔ ａａａａｔｃｃｃａｇ ｇａｃｃｇｃｃａｃｃ ｔａｔｃａｔａｔａｃ ａｔａｃａｔｇａｔｃ６０ｔｔｃｔａａａｔａｃ ｃｃｇａｔｃａｇａｇ ｃｇｃｔａａｇｃａｇ ｃａｇａａｔｃｇｔｇ ｔｇａｃａａｃｇｃｔ ａｇｃａｇｃｔｃｔｃ １２０ｃｔｃｃａａｃａｃａ ｔｃａｔｃｇａｃａａ ｇｃａｃｃｔｔｔｔｔ ｔｇｃｃｇｇａｇｔａｔｇａｃｇｇｔｇａｃ ｇａｔａｔａｔｔｃａ １８０ａｔｔｇｔａａａｔｇ ｇｃｔｔｃａｔｇｔｃ ｃｇｇｇａａａｔｃｔ ａｃａｔｇｇａｔｃａ ｇｃａａｔｇａｇｔａ ｔｇｇｔｇｇｔｃａａ ２４０ｔａｔｇｇａｇａａａ ａａｇａａａｇａｇｔ ａａｔｔａｃｃａａｔ ｔｔｔｔｔｔｔｃａａ ｔｔｃａａａａａｔｇ ｔａｇａｔｇｔｃｃｇ ３００ｃａｇｃｇｔｔａｔｔ ａｔａａａａｔｇａａ ａｇｔａｃａｔｔｔｔ ｇａｔａａａａｃｇａ ｃａａａｔｔａｃｇａ ｔｃｃｇｔｃｇｔａｔ３６０ｔｔａｔａｇｇｃｇａ ａａｇｃａａｔａａａ ｃａａａｔｔａｔｔｃ ｔａａｔｔｃｇｇａａ ａｔｃｔｔｔａｔｔｔ ｃｇａｃｇｔｇｔｃｔ ４２０ａｃａｔｔｃａｃｇｔ ｃｃａａａｔｇｇｇｇ ｇｃｔｔａｇａｔｇａ ｇａａａｃｔｔｃａｃｇａｔｔｔｇｇｃｇｃ ｇｃｃａａａｇｃｔｔ ４８０ａｃｔｃｇａｇｇｔｃ ａｔｔｃａｔａｔｇｃ ｔｔｇａ ５０４。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：路兴波，袁磊，孙红炜，武海斌，李凡，韩伟，
申请(专利权)人：山东省农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：88
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