水稻白叶枯病菌抗链霉素检测基因及其检测方法技术

本发明专利技术是水稻白叶枯病菌(Xanthomonas?oryzae?pv.oryzae)抗链霉素的检测基因及其检测方法，专门用于水稻白叶枯病菌对链霉素产生抗药性菌株的诊断和检测。本发明专利技术首次报道了水稻白叶枯病菌存在编码氨基糖苷-3-羟基腺苷转移酶的aadA1抗链霉素的特异性基因。该基因由792个核苷酸组成，编码一种由263个氨基酸残基组成的蛋白质。该特异性核苷酸序列可用于自然界中抗链霉素的水稻白叶枯病菌菌株诊断和检测。基于该基因序列设计引物和采用常规的PCR方法，可以快速、准确诊断和检测田间病株或病残体上的病原细菌对链霉素的抗药性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae)抗链霉素检测基因及其检测方法，属于植物病原细菌抗药性的检测方法，专用于诊断抗链霉素的水稻白叶枯病菌菌株及监测水稻白叶枯病菌群体对链霉素抗药性的发展动态。
技术介绍
7jC稻白叶枯病是由Xanthomonas oryzae pv. oryzae引起的一种细菌性病害，严重影响水稻产量。由于世界上缺乏防治细菌性病害的高效杀菌剂，长期以来采用治疗人类细菌疾病的氨基糖苷类抗生素链霉素来防治细菌性作物病害。在我国采用链霉素防治水稻白叶枯病已经有30多年的历史。链霉素作用于核糖体30S亚基，导致遗传密码的错读，引起mRNA翻译起始的抑制和异常校读。在医学上很早就发现人类病原细菌极易对链霉素产生抗药性，其抗药性机制主要为以下两大类。第一类是由于核糖体结合位点的改变而导致的抗药性。编码S12 核糖体蛋白的rpsL基因及编码16S rRNA的rrs基因突变都会使核糖体靶位点改变， 使细菌对链霉素产生显著水平的抗药性。第二类是由于存在氨基糖苷类抗生素修饰酶 (aminoglycoside-modifying enzymes)，钝化链霉素而引起的抗药性。已知链霉素的修饰酶主要包括以下4种氨基糖苷-3-羟基腺苷转移酶AADA (ANT (3 “ ) _1)、氨基糖苷_6_羟基腺苷转移酶ANT(6' )_1、氨基糖苷-3-磷酸转移酶STRA(APH(3" )_Ib)和氨基糖苷-6-磷酸转移酶STRB(ΑΡΗ(6‘ )_Id)。抗药性细菌代谢链霉素较常见的修饰酶为氨基糖苷-3-羟基腺苷转移酶AADA I (ANT (3 “ ) -I)，该酶修饰链霉素的3 “-羟基位置和壮观霉素(spectinomycin，另名大观霉素)的9-羟基位置，由ant(3" )_Ia编码。ant(3" )_Ia 基因在G-细菌中较为普遍，且它常存在于转座子和抗药性整合子(resistance integron) 的基因盒(gene cassette)中。在G+细菌中的 Staphylococcus aureus 禾口 Corynebacterium glutamicum中曾发现过aadA基因的存在。迄今为止，aadA基因在人类、动物、动物源食品、 灌溉水及河床沉淀物中均有发现。Siaw et al. (1991)研究表明在1462株表现链霉素抗药性的临床医学细菌菌株中，55. 的菌株含有aadAl基因。在临床医学病原菌中，I型整合子携带 aadA 最常见于肠杆菌禾斗 Enterobacteriaceae, Pseudomonas aeruginosa 禾口 Vibrio choIerae中。但目前为止还未报道过在植物病原菌中存在aadA基因。植物病原细菌中的strA-strB基因已有研究发现植物病原细菌也容易对链霉素产生抗药性，其抗药性最主要的机制是strA和StrB基因的存在，这两个基因分别编码氨基糖苷-3-磷酸转移酶(aminoglycoside-3-phosphotransferase)和氨基糖苷_6_磷酸转(aminoglycoside-6-phosphotransferase), strA、 strB^^Jil1J^v^J^^aph(3〃)H^Paph(6)-Id。strA和strB基因最常见于转座子Tn5393上，且这个转座子多存在于较大的质粒上。由于strA和strB基因的存在导致链霉素抗药性的植物病原细菌包括 Ε.amylovora, Erwinia herbicola，Pseudomonas syringae pv.papulans，Pseudomonassyringae pv. syringae，禾口 Xanthomonas campestris ρν·vesicatoria。水稻白叶枯病菌链霉素田间抗性菌株的抗性分子机制申请者通过PCR扩增和基因测序等，比较研究了水稻白叶枯病菌对链霉素表现抗性和敏感菌株，发现在抗链霉素的水稻白叶枯病菌菌株中均含有I型整合酶基因int I和编码链霉素修饰酶的基因一氨基糖苷-3-羟基腺苷转移酶基因aadAl，而在田间敏感菌株中均不含有I型整合酶基因int I 和编码链霉素修饰酶的氨基糖苷-3-羟基腺苷转移酶基因aadAl ；进一步研究表明，水稻白叶枯病菌对链霉素的抗药性性状主要是由整合子中的aadAl基因控制的。因此，利用仅在抗链霉素的水稻白叶枯病菌菌株中存在aadAl基因，而在敏感菌株中不存在该基因的差异，可以设计引物采用常规的PCR方法区分抗药性菌株和敏感性菌株。本专利首次报道了植物病原细菌中抗药性整合子的存在。传统的检测方法需要分离、培养、病原菌鉴定，然后在含药培养基上培养，再根据药剂对细菌生长的效应鉴别其抗药性，操作繁琐，效率低。本专利技术在抗药性分子机制研究基础上，采用常规的PCR方法，能快速、准确检测抗链霉素的水稻白叶枯病菌菌株。它具有一下优点(1)快速、准确检测出抗链霉素的水稻白叶枯病菌菌株；( 可操作性强，步骤简单，仅需3 5小时就能够获得结果；(3)诊断结果能够说明其抗药性机制，对于抗药性治理具有指导意义。
技术实现思路
技术问题本专利技术的目的在于提供水稻白叶枯病菌抗链霉素的检测基因及一种快速诊断或检测抗链霉素的水稻白叶枯病菌菌株的方法。该检测方法首次根据抗药性菌株特有aadAl基因的性质，利用常规PCR技术成功实现了快速、准确地对抗链霉素水稻白叶枯病菌菌株的分子诊断或检测，检测准确率达到100%，对及时、有针对性地采取抗药性治理措施，防止抗药性病害流行具有实用价值。技术方案与敏感菌株相比，抗链霉素的水稻白叶枯病菌菌株中存在着特有的 aadAl基因。该基因全长为792bp，编码一种由263氨基酸残基组成的氨基糖苷-3-羟基腺苷转移酶，属于链霉素修饰酶。利用该特征，将抗链霉素水稻白叶枯病菌的aadAl作为该病原菌抗链霉素的检测基因。基于该基因序列设计特异性引物，采用常规PCR方法，就能够把抗链霉素的水稻白叶枯病菌菌株从敏感菌株中鉴定出来。抗链霉素的水稻白叶枯病菌菌株检测方法，共分三步第一步采用常规的苯酚·氯仿·异戊醇法，分别提取待测病叶、病残体的基因组 DNA。第二步运用常规PCR反应，扩增。扩增水稻白叶枯病菌aadAl基因片断引物对上游引物aadA I-F :5' -ATGAGGGAAG CGGTGATCGC C-3'下游引物aadA I-R :5' -TCTTCCAACT GATCTGCGCG C-3'PCR扩增的反应体系PCR buffer (IOX)2. 5 μ LdNTP(2. 5mM each)2μ LaadAl-F (10 μ Μ)0. 5 μ LaadAl-R(lOyM)0. 5 μ LdH20 (灭菌蒸馏水)18. 3 μ LTaq DNA 聚合酶(5U/ μ L)0. 2 μ LDNA 模板l.OyL_总体积25 μ L扩增条件预变性94°C5minI变性94°C60s退火67°C60s延伸72°C60s31个循环I延伸72°CIOmin第三步电泳；根据电泳图谱中是否出现74!3bp的目标片段，确定待测病叶、病残体中是否存在抗链霉素的水稻白叶枯病菌菌株。有益效果本专利技术是抗链霉素本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．水稻白叶枯病菌（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ　ｏｒｙｚａｅ　ｐｖ．ｏｒｙｚａｅ）抗链霉素检测基因ａａｄＡ１，全长为７９２ｂｐ，编码一种由２６３个氨基酸残基组成的氨基糖苷－３－羟基腺苷转移酶蛋白质；基因全序列见ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．１。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：周明国，陈长军，王建新，徐颖，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：84