本发明专利技术公开一种用于三种食源性致病菌多重快速检测法及检测引物组和试剂盒。沙门氏菌的快速检测引物组的上游引物具有如SEQNo.1所示的序列，其下游引物具有如SEQNo.2所示的序列；志贺氏菌的快速检测引物组的上游引物具有如SEQNo.3所示的序列，其下游引物具有如SEQNo.4所示的序列；金黄色葡萄球菌的快速检测引物组的其上游引物具有如SEQNo.5所示的序列，其下游引物具有如SEQNo.6所示的序列。利用上述检测引物组对待测样品中所提取的细菌的基因组DNA，在同一反应体系中进行LAMP反应，通过对反应产物的鉴定来判定样品中是否含有沙门氏菌、志贺氏菌或金黄色葡萄球菌。各检测引物组特异性强，能在同一反应体系中准确检测沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌基因组DNA。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属微生物检测领域，涉及一种沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌三重快速检测方法及其检测引物组和检测试剂盒。
技术介绍
沙门氏菌印/ )是公共卫生领域的重要致病菌，属革兰氏染色阴性肠杆菌。据统计在世界各国发生的细菌性食物中毒中，沙门氏菌引起的食物中毒常列榜首， 我国内陆地区所发生的细菌性食物中毒中也以沙门氏菌为首要原因。除引发食物中毒外， 该属的细菌还可以导致胃肠炎、伤寒和副伤寒等疾病。志贺氏菌5^)属革兰氏染色阴性肠杆菌，是人类细菌性痢疾最常见的病原菌。近年来，志贺氏菌I型的细菌性痢疾已发展为世界性流行趋势，我国至少在十余个省区发生了不同规模流行。金黄色葡萄球菌 {Staphylococcus aareM)隶属于葡萄球菌属，革兰氏染色呈阳性。金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等， 甚至败血症、脓毒症等全身感染。金黄色葡萄球菌肠毒素是个世界性卫生难题，我国每年发生的此类中毒事件也非常多。根据现行有效的国家标准和行业标准，几乎所有的食品均需对这三种食源性致病菌进行检测以排除其污染。常规检测采用传统培养方法，且每个致病菌需应用独立的检测方法单独进行检测，工作量大，检测周期长，且受到检测人员专业、经验等多种因素限制，容易出现误判。随着分子生物学方法在食品微生物检测中的逐步应用，致病菌的检测效率也逐步提升。但目前所采用的普通PCR方法和荧光PCR方法虽可提高检测效率，但对仪器设备要求较高，对检测人员的专业背景和检测能力也有一定要求，因此无法大范围的推广使用。LAMP方法是一种新型的恒温核酸扩增技术，该技术主要利用4种不同的特异性引物识别靶DNA上6个特定区域，并利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶(feiDNA)，在恒温条件下快速扩增核酸，保证了扩增的高特异性和高效率。由于LAMP独特的核酸扩增机制， 它的产物是由多重复靶序列的茎一环状DNA和花椰菜状DNA所组成的混合物，在琼脂糖凝胶电泳上会呈现出LAMP反应典型的阶梯状条带；同时，核酸大量生成时，从dNIPs中析出的焦磷酸根离子与反应体系中的Mg2+结合，产生肉眼可见的扩增反应副产物-白色焦磷酸镁沉淀；另外，由于扩增产物大量生成，加入荧光染料(如Syber Green I、溴化乙锭、Gel Red 等)。因此LAMP扩增结果不但观察方式多样，且结果鉴定简单，非常适合高通量的快速检测。鉴于LAMP技术有众多优势，现已被逐渐应用于病原微生物的检测。如分支杆菌属、阪崎肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等。但目前已有的方法只能在一个系统中针对某一种致病菌进行检测，在需要快速筛查多个致病菌时，需分别对其进行检测，仍有较大工作量。多重恒温核酸检测技术能在同一反应体系中，同一反应条件下，实现多个目的菌的快速筛查，具有广阔的应用前景。经国内外文献查询，尚未见有LAMP应用于沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌多重快速检测的相关报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种三种食源性致病菌多重快速检测法及检测引物组和试剂盒。为实现上述目的，本专利技术所采取的技术方案是本专利技术沙门氏菌的快速检测引物组的上游引物具有如SEQ No. 1所示的序列，下游引物具有如SEQ No. 2所示的序列。本专利技术志贺氏菌的快速检测引物组的上游引物具有如SEQ No. 3所示的序列，下游引物具有如SEQ No. 4所示的序列。本专利技术金黄色葡萄球菌的快速检测引物组的上游引物具有如SEQ No. 5所示的序列，下游引物具有如SEQ No. 6所示的序列。本专利技术使用引物组对沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌进行多重快速检测的方法是将沙门氏菌的检测引物组、志贺氏菌的检测引物组和金黄色葡萄球菌的检测引物组与待测样品的DNA进行LAMP反应，反应结束后对反应液进行阴阳性判定，以确定样品中是否含有沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌中的任一种或任几种；其中，所述沙门氏菌的检测引物组中的上游引物具有如SEQ No. 1所示的序列、下游引物具有如SEQ No. 2所示的序列，所述志贺氏菌的检测引物组中的上游引物具有如SEQ No. 3所示的序列、下游引物具有如SEQ No. 4所示的序列，所述金黄色葡萄球菌的检测引物组中的上游引物具有如SEQ No. 5所示的序列、下游引物具有如SEQ No. 6所示的序列。进一步地，本专利技术所述LAMP反应按以下第一种方案或第二种方案进行 第一种方案所述LAMP反应在59. 5-62. 5°C下反应70_110min ；第二种方案所述LAMP反应包含以下步骤(1)先在59. 5-62. 5°C下反应 70-1 IOmin ；(2)后在80°C下反应6-12min。进一步地，本专利技术在进行所述LAMP反应的反应液中，所述沙门氏菌的检测引物组中的上游引物和下游引物的浓度均为0. 2-0. 3μΜ，所述志贺氏菌的检测引物组中的上游引物和下游引物的浓度均为0. 2-0. 3μΜ，所述金黄色葡萄球菌的检测引物组中的上游引物和下游引物的浓度均为0. 2-0. 3 μ Μ,并且，还包含有浓度为0. 6-0. 7 M的甜菜碱、浓度为 3. 8-5. 4mM的MgS04、10 % (体积)的IOXfeiDNA聚合酶缓冲液、浓度为0. 4-0. 6U/μ L的 feiDNA聚合酶、浓度各为0. 6-1. OmM的三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸和三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸。本专利技术快速检测试剂盒包括沙门氏菌的检测引物组、志贺氏菌的检测引物组、金黄色葡萄球菌的检测引物组、三种阳性对照品、Bs DNA聚合酶、10 Xfe DNA聚合酶缓冲液、 MgSO4溶液、甜菜碱溶液、三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸和无菌超纯水；所述沙门氏菌的检测引物组中的上游引物具有如SEQ No. 1所示的序列、下游引物具有如SEQ No. 2所示的序列，所述志贺氏菌的检测引物组中的上游引物具有如SEQ No. 3所示的序列、下游引物具有如SEQ No. 4 所示的序列，所述金黄色葡萄球菌的检测引物组中的上游引物具有如SEQ No. 5所示的序列、下游引物具有如SEQ No. 6所示的序列，所述三种阳性对照品分别为沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌的标准菌株的基因组DNA。本专利技术快速检测试剂盒的LAMP反应液中，包含有沙门氏菌的检测引物组、志贺氏菌的检测引物组、金黄色葡萄球菌的检测引物组、甜菜碱、BstmA聚合酶、IOXfeiDNA聚合酶缓冲液、MgSO4溶液、三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸和无菌超纯水，其中，所述沙门氏菌的检测引物组中的上游引物和下游引物的浓度均为0. 2-0. 3μΜ，所述志贺氏菌的检测引物组中的上游引物和下游引物的浓度均为0. 2-0. 3 μ Μ，所述金黄色葡萄球菌的检测引物组中的上游引物和下游引物的浓度均为0.2-0. 3 μ Μ，所述甜菜碱的浓度为0.6-0. 7 Μ, MgSO4的浓度为 3. 8-5. 4mM, 10 % (体积)的IOXfeiDNA聚合酶缓冲液，feiDNA本文档来自技高网...
【技术保护点】
１． 一种沙门氏菌的快速检测引物组，其特征是：其上游引物具有如ＳＥＱ Ｎｏ．１所示的序列，其下游引物具有如ＳＥＱ Ｎｏ．２所示的序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：姜侃，张东雷，金燕飞，黄建锋，汪新，李洪波，
申请(专利权)人：浙江省质量技术监督检测研究院，李洪波，
类型：发明
国别省市：86
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