本发明专利技术涉及一种猪脾转移因子注射液的生产方法。改进生产方法采用的是低温超声波裂解法，比较上述工艺技术其主要特点在于，低温超声波裂解法产生的超声波和局域超高压物理强化条件，实现对脾脏组织和细胞的破碎，能够保护加工材料原有生物活性成分不被破坏，并能获取纯天然的高效生物活性物质和全价氨基酸。该方法在保证产品安全性的基础上，不但避免了传统高温生物灭活方法所带来的活性成分损失的弊端，使生产工艺和生产条件大大简化，极大地降低了生产成本，显著提高了生产效率，具备规模化生产的必备条件。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种用于生产猪脾转移因子注射液的方法，属于兽用生物制品领域。
技术介绍
1949年，Lawrence首次发现结核菌素阳性供者的活淋巴细胞能使皮试阴性受者转变为皮试阳性。以此为依据，1953年至1955年，Lawrence等将其对应的白细胞可透析物质(DLE)重复实验后，发现DLE具备活淋巴细胞同样的功能，即其提取物仍具有转移迟发型变态反应的作用，并将这种能将供体的某种特定的细胞免疫功能特异地传给受体，使受体也具有该种细胞免疫力的物质称为转移因子(Lawrence HS. Transfer Factor *Advan Immunol,1969,(2) :195 ；Lawrence HS. The transfer in human of delayed skin sensitivity to Streptococcal M Substance and to tuberculinwith Disrupted Leucocytes · Clin Invest,1955,34) :219)。目前，在抗病毒的预防和治疗中，急需的是一种具有良好的活化机体细胞免疫功能的免疫增强剂和能够恢复机体正常免疫水平的免疫调节剂。二者应具有以下特性能促进体液和细胞介导的免疫，也能作用于弱免疫性抗原；能以不同途径使用，也能用于不同抗原；能在免疫抑制个体中发挥调节作用；用于食用动物不应有毒素残留；能有效影响免疫反应，质量稳定；廉价且容易生产。当今在生物制品中关于免疫增强剂方面是研究的热点， 其中又以微量、高效、无残留特性的转移因子更受关注。据报道，动物TF的化学本质为一种小肽与寡核苷酸复合物，能自由通过半透膜。粗制TF是小分子多肽和多核苷酸物质，含有 K、Na、Ca、Mg、Zn等金属元素，多核苷酸含核糖和碱性腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、6种以上氨基酸，等电点为4. 48，其多肽部分富含天冬氨酸，肽链N末端可能封闭，多肽与小分子RNA比例为2 1。由于TF分子质量小，不具抗原性，应用后不刺激机体产生抗体，而不会被抗体中和，可以反复使用，结合并激活淋巴细胞(Lawrence HS. Transfer Factor 'Advan Immunol, 1969，(2) 195 ；孙卫民，王惠琴.细胞因子研究方法学.北京人民卫生出版社，2001 ；祁海燕，万芷芳.山羊单纯疙疹病毒I型特异性转移因子活性成分的生化鉴定.第四军医大学学报，1992，14(2) :113-115;何理平.转移因子在动物医学上的研究进展.湖北畜牧兽医， 2003， (6) 44-49).)
技术实现思路
本专利技术是以健康猪脾脏为原料，经预处理、勻浆、超声裂解、超滤分离、灭活等一系列生产工艺，用于生产猪脾转移因子注射液。猪脾转移因子注射液的生产方法，主要是1.预处理取健康新鲜或冷冻的猪脾脏，去除外包装解冻(勿损内包装)，放入缓冲区，用1%TH4+(TH4+为复方季铵盐消毒剂，商品名称为“法国TH4消毒液”,法国S0GEVAL 生产，上海罗曼动物保健品公司代理销售)浸泡消毒5min后，去除内包装。称取脾脏，先用纯化水清洗3次，再用注射用水清洗1次，洗毕控水。剔除脾脏被膜上的脂肪组织、系膜，用灭菌生理盐水清洗脾脏2次，称重。2.勻浆将脾脏用绞肉机(JR-100D，诸城市华都机械科技有限公司)绞碎，按1 1比例加入灭菌注射用水后用勻浆机O4CB10C，美国Waring生产)勻浆。3.超声裂解取勻浆液在超声波粉碎仪(B⑶-2000，必能信(美国)有限公司生产)中超声裂解0 8°C)，收取裂解后的浆液，-20°C冻存待用。4.超滤分离浆液经4°C，6000r/min离心15min，收集上清液，经5μπι滤柱 (5μπι，天津膜天膜有限公司生产)预滤后，再通过30KDa的中空纤维超滤柱过滤(30KDa，天津膜天膜有限公司生产)，然后经过6KDa的中空纤维超滤柱(6KDa，天津膜天膜有限公司生产)过滤即为原液。5.灭活向原液中加入最终浓度为0. 05%的甲醛溶液，37°C灭活12h，2 8°C保存，应不超过14日。具体实施例方式一、猪脾转移因子注射液的制备1.脾脏的预处理取出采集或定点存放的猪脾脏，去除外包装解冻(勿损内包装)，放入缓冲区，用TH4+浸泡消毒5min后，去除内包装。清洗称取脾脏，先用纯化水清洗3次，再用注射用水清洗1次，洗毕控水。除脂肪剔除脾脏被膜上的脂肪组织、系膜，用灭菌生理盐水清洗脾脏2次，称重。2.勻浆将脾脏用绞肉机(JR-100D，诸城市华都机械科技有限公司生产)绞碎， 按1 1比例加入灭菌注射用水后用勻浆机(24CB10C，美国Waring生产)勻浆。3.超声裂解取勻浆液在超声波粉碎仪(B⑶-2000，必能信(美国)有限公司生产)中超声裂解0 8°C)，收取裂解后的浆液，-20°C冻存待用。4.超滤分离浆液经4°C，6000r/min离心15min，收集上清液，经5μπι滤柱 (5μπι，天津膜天膜有限公司生产)预滤后，再通过30KDa的中空纤维超滤柱(30KDa，天津膜天膜有限公司生产)过滤，然后经过6KDa的中空纤维超滤柱(6KDa，天津膜天膜有限公司生产)过滤即为原液。5.灭活向原液中加入最终浓度为0.05%的甲醛溶液，37°C灭活12h。，2 8°C保存，应不超过14日。6.半成品检验1.无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行检验。2. pH值测定按现行《中国兽药典》附录进行测定。3.蛋白质定性取20%磺基水杨酸溶液2ml与半成品anl，混合，仔细观察混合后溶液是否有白色沉淀或浑浊。4.鉴别检验将半成品做1 10稀释，按分光光度法(见现行《中国兽药典》附录)测定ODa5tln^ OD28tlnm值，并扫描图谱，在051±2)nm波长处是否有最大吸收。计算在的比值。5.多肽含量测定按福林酚法(《中国药典》中转移因子溶液质量标准中的附注 1)进行测定。6.核糖含量测定按核糖含量测定法(《中国药典》中转移因子溶液质量标准中的附注2)进行测定。7.细菌内毒素检验按细菌内毒素法(参照由美国ACC生产的细菌内毒素检测试剂盒说明书)进行检验。8.分装根据多肽和核糖含量测定结果，将检验合格的半成品无菌定量分装，加塞，轧盖即成成品。二、猪脾转移因子注射液成品检验1.性状微黄色或淡黄色透明液体。2. pH值测定按现行《中国兽药典》附录进行测定，PH值应为6. 0 7. 0。3.无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。4.安全检验(1)热原质检验用体重1. 7 3. Okg健康家兔(雌兔应无孕)3只，单独饲养2 日，应无异常。每隔30min测量体温1次，测量2次，两次温差不能超过0. 2°C，以此两次体温的平均值作为该兔的正常体温。当日使用的家兔，正常体温应在38. 0 39. 6°C的范围内，且各兔间正常体温之差不得超过1°C。试验用的注射器、针头及一切与本品接触的器皿， 应灭热原。家兔在测定其正常体温15min以内，自耳静脉缓缓注入规定剂量(注射量为每公斤体重0. 5ml)并温热至约38°C的本品，然后每隔30min测温1次，共测6次，以6次体温中最高的一次减去正常体温，即为该兔体温升高的温度(当家兔升温为负值时，均以0°C 计)。本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种猪脾转移因子注射液的生产方法，其特征主要包括以下几个步骤：（１）预处理 取健康新鲜或冷冻的猪脾脏，去除外包装解冻，放入缓冲区，用１％ＴＨ４＋浸泡消毒５ｍｉｎ后，去除内包装；称取脾脏，先用纯化水清洗３次，再用注射用水清洗１次，洗毕控水；剔除脾脏被膜上的脂肪组织、系膜，用灭菌生理盐水清洗脾脏２次，称重；（２）匀浆 将脾脏用绞肉机绞碎，按１∶１比例加入灭菌注射用水后用匀浆机匀浆；（３）超声裂解 取匀浆液在超声波粉碎仪中在２～８℃超声裂解后收取裂解后的浆液，－２０℃冻存待用；（４）超滤分离 浆液经４℃，６０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ，收集上清液，经５μｍ滤柱预滤后，再通过３０ＫＤａ的中空纤维超滤柱过滤，然后经过６ＫＤａ的中空纤维超滤柱过滤即为原液；（５）灭活向原液中加入最终浓度为０．０５％的甲醛溶液，３７℃灭活１２ｈ；抽样进行半成品检验，２～８℃保存，应不超过１４日。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘蕾，范根成，杜元钊，胡潇，陶晓珊，邹敏，申洪银，
申请(专利权)人：青岛易邦生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：95
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