本发明专利技术属于病毒检测领域，涉及一种用于检测猪瘟病毒野毒株的引物对、探针、以及试剂盒。具体地，所述引物对其中一条引物包含SEQ?ID?NO：5所示的核苷酸序列，另一条引物包含SEQ?ID?NO：10所示的核苷酸序列。本发明专利技术还涉及一种检测猪瘟病毒野毒株的方法以及所述的引物对、探针、或试剂盒在检测猪瘟病毒野毒株中的用途。本发明专利技术的优点是快速简便、特异性强、敏感性高、可靠性好、检测成本低、时间短(加上核酸提取，仅需1.5小时)、检测效率高、准确性高、假阳性低等。本发明专利技术试剂盒能检测猪瘟病毒野毒株，不能检测到疫苗株和其它非猪瘟病毒野毒株，为猪瘟疫情的监测、防控提供强有力的技术支持，有很好的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于病毒检测领域，涉及一种用于检测猪瘟病毒野毒株的引物对、探针、以及试剂盒。本专利技术还涉及一种检测猪瘟病毒野毒株的方法以及所述的引物对、探针、或试剂盒在检测猪瘟病毒野毒株中的用途。
技术介绍
猪痕(ClassicalSwine Fever, CSF)是由猪痕病毒(Classical Swine FeverVirus, CSFV)引起的猪的高度致死性、接触性传染病，在世界上许多国家和地区均有发生，国际兽疫局将其定为A类传染病，我国《动物防疫法》将其列为一类传染病，给各国养猪业造成巨大的经济损失。我国政府一直都很重视猪瘟的防制工作，并对猪进行猪瘟兔化弱毒疫苗免疫，但随着猪瘟HCLV疫苗的广泛使用，又由于近年来我国猪瘟的流行特点以散发、慢性猪瘟、持续感染和亚临床症状为主，同时存在着与其它病混合感染的状况，因此对其诊断非常困难。目前尚没有简单快速试剂盒能够检测猪瘟病毒野毒株(除猪瘟疫苗株之外的猪瘟病毒株)感染。实时荧光定量PCR(FQ_PCR，又称为实时荧光RT-PCR)技术包括探针法、染料法和引物法。探针法是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加，以Taqman探针为代表，常用的荧光报告基团是FAM、VIC、JOE、HEX等；染料法是采用一种能够与双链DNA小沟结合的荧光染料，荧光信号强弱与双链DNA的数量相关，可以根据荧光信号换算出PCR反应中的双链DNA数量，常用的染料是SYBR green ;引物法是利用荧光标记的引物实现定量，目标特异的引物对中的一个引物3’端用荧光报告基团标记，在没有单链模板的情况下，该引物自身配对，形成发夹结构，使荧光淬灭，在模板存在的情况下，引物与模板配对，发夹结构打开，产生特异的荧光信号。在荧光定量检测中较常用的是Taqman探针法，根据其3’端标记的荧光淬灭基团的不同又可分为常规Taqm an探针和Taqman-MGB探针两种。常规的Taqman探针5 ’端标以荧光发射基团，3’端标以荧光淬灭基团，该探针在PCR过程中不能被延伸。当探针保持完整时，3’端淬灭基团抑制5’发射基团的荧光发射。在PCR的退火期，探针与引物所含序列内的DNA模板发生特异性杂交。延伸期引物在Taq酶作用下延伸，当到探针处，Taq酶发挥5’ _3’外切核酸酶活性，继而发生置换。切断探针后，发光基团远离淬灭基团，荧光信号得到释放。这时荧光探测系统便会检测到光密度有所增加。模板每复制一次，就有一个探针被切断，并伴有一个荧光信号的释放。由于理论上被释放的荧光基团数目和PCR产物数量是一对一的关系，且光密度同释放的荧光基团数目和PCR产物数量是一对一的关系，且光密度同释放的荧光基团的数目也成正比关系，因此该技术可对模板进行准确定量。由于扩增产物较短时效率较高，故扩增长度一般为50-150bp。Taqman-MGB探针与普通Taqman水解探针不同之处在于Taqman-MGB探针的3’端连接一个不发光的淬灭基团，同时另增加一个小沟结合物(minor groove binder, MGB)分子，比Taqman探针有三大优势一是显著提高Tm值，可以减少探针设计长度，对AT富含区的探针设计更为有利；二是可以降低背景荧光信号，提高信噪比，使实验结果更精确，分辨率更高；三是提高探针和互补模板的结合特异性，即使一个碱基的不匹配都能精确分辨。目前检测猪瘟病毒的病原学诊断技术有病毒分离法、免疫荧光技术、兔体交互免疫试验、ELISA抗原捕获、RT-PCR技术和实验动物法等。以上几种方法及其不太成熟的试剂盒通常存在灵敏度低、特异性差、耗时、无法区分免疫群与感染群等诸多问题，不能为我国快速、有效地监控猪瘟疫情提供强有力的技术支持。公开号为CN101328506A和CN101812539A的专利申请公开了检测猪瘟病毒的试剂盒。但是检测的敏感性有待于进一步提高。此外，CN101328506A中公开的试剂盒生产成本高并且操作繁琐。因此，亟需一种敏感性高、特异性强、并且快速简便的检测“猪瘟病毒野毒株”的产品和方法。
技术实现思路
本专利技术人经过创造性的劳动和大量的试验，得到了能够用于检测猪瘟病毒野毒株的引物对和探针，并且惊奇地发现，所述引物对和探针检测猪瘟病毒野毒株的特异性强、灵敏度高。由此提供了下述专利技术本专利技术的一个方面涉及一种引物对(包含两条引物)，其中一条引物包含SEQ IDNO :5所示的核苷酸序列，另一条引物包含SEQ ID NO: 10所示的核苷酸序列。在本专利技术的一个实施方案中，所述的引物对，其中，一条引物的核苷酸序列如SEQ ID NO :5所示，另一条引物的核苷酸序列如SEQ ID NO :10所示。在本专利技术的一个实施方案中，所述引物对由两条引物组成，其中，一条引物的核苷酸序列如SEQ ID NO :5所示，另一条引物的核苷酸序列如SEQ ID NO 10 所示。5，-AACTGGGCTAGCCATGCCCACAGT-3，(CSF-WF4, SEQ ID NO 5)；5’ -TGTACTCAGGACTTAGACCACCCA-3’ (CSF-WR2, SEQ ID NO 10)。上述引物对能够用于检测猪瘟病毒野毒株。本专利技术的另一方面涉及一种探针，其包含SEQ ID NO :16所示的核苷酸序列。在本专利技术的一个实施方案中，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID N0:16所示。5’ -CGCCACTACGGCTAGT-3，(CSF-WP3, SEQ ID NO 16)。本专利技术的探针能够用于检测猪瘟病毒野毒株。具体地，所述探针带有可检测的标记。根据本专利技术任一项所述的探针，其为自身淬灭探针。根据本专利技术任一项所述的探针，其5’端标记有荧光发射基团，3’端标记有荧光淬灭基团。根据本专利技术任一项所述的探针，其中，所述荧光发射基团选自FAM、VIC、J0E、和HEX ;所述荧光淬灭基团选自TAMRA、BHQjP MGB。根据本专利技术任一项所述的探针，其3’端结合有小沟结合物(MGB)。所述引物和探针可以根据本领域的现有技术合成，也可以委托专业的公司制备。 本专利技术的还一方面涉及一种组合物，其含有本专利技术的引物对和/或者本专利技术任一项所述的探针。所述组合物能够用于检测猪瘟病毒野毒株。本专利技术的还一方面涉及一种试剂盒，其包含本专利技术的引物对和本专利技术任一项所述的探针。根据本专利技术任一项所述的试剂盒，其还包含RT-PCR反应缓冲液、反转录酶和Taq酶；具体地，所述反转录酶为高效反转录酶(仅在5分钟内就可从高拷贝基因中生产大量的cDNA，普通反转录酶需半小时)，所述Taq酶为热启动Taq酶。根据本专利技术任一项所述的试剂盒，其中，所述引物对溶于RT-PCR反应缓冲液，其浓度为 IOpmoL/ μ L。根据本专利技术任一项所述的试剂盒，其还包含RNA提取试剂。根据本专利技术任一项所述的试剂盒，其还包含阳性对照和阴性对照，其中，所述阳性对照为猪瘟石门标准毒株，经灭活后得到；所述阴性对照为猪瘟疫苗株，经灭活后得到。在本专利技术一个具体的实施方案中，所述的试剂盒，包含a)裂解液、b)洗液、c)洗脱液、d)吸附柱和收集管、e)阴性对照、f)阳性对照、g)RT-PCR反应液、h)酶混合液、j)荧光探针、k)无菌无核酸酶水；RT-PCR反应液含有上游引物CSF-WF和下游引物 本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种引物对，其中一条引物包含ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５所示的核苷酸序列，另一条引物包含ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０所示的核苷酸序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：孙明，陈西钊，陈南华，乔明明，陈曦，田克恭，
申请(专利权)人：北京世纪元亨动物防疫技术有限公司，
类型：发明
国别省市：11
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