本发明专利技术公开了一种酵母展示脂肪酶催化合成维生素C共轭亚油酸酯的方法，包括：将L-抗坏血酸和共轭亚油酸溶于有机溶剂中，加入酵母展示脂肪酶，无氧条件下于50～60℃反应4～8小时，分离、纯化制得L-抗坏血酸共轭亚油酸酯；将经线性化处理的重组质粒转入毕赤酵母(Pichia?pastoris)GS115，将所得转化子接种于BMMY培养基中，诱导培养72～144小时后离心收集菌体，菌体经冲洗、生物印迹和冷冻干燥制得酵母展示脂肪酶；本发明专利技术通过将脂肪酶展示在细胞外，利用该酶制剂催化合成L-抗坏血酸共轭亚油酸酯，不仅提高了转化效率，而且缩短了反应时间，降低了生产成本。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物工程
，尤其涉及一种酵母展示脂肪酶催化合成L-抗坏血酸共轭亚油酸酯的方法。
技术介绍
BHA、BHT、PG、TBHQ等合成抗氧化剂广泛用于食品工业，但是由于存在致癌，体内消化后有毒性等安全隐患，其食用越来越受质疑，天然抗氧化剂也因此备受青睐。L-抗坏血酸(维生素C)是目前使用最多的天然抗氧化剂之一，随着两步发酵法生产维生素C技术的不断成熟，我国生产维生素C产量已居世界之首，生产成本也相对较低。然而，维生素C是水溶性的天然抗氧化剂，只能在水相体系发挥作用，但食品体系往往是油相或者是多相的， 这就大大局限了维生素C的使用范围。将合适的亲油性基团“嫁接”到维生素C上合成脂溶性衍生物，从而改变其亲水性及溶解性可有效解决这一问题。L-抗坏血酸共轭亚油酸酯 (L-ascorbyl conjugated linoleate)是维生素C上“嫁接”共轭亚油酸的衍生物，共轭亚油酸是是一类含有共轭双键的亚油酸异构体混合物，大量研究证实其具有重要生理功能如抗氧化，抗肿瘤，降胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白，提高免疫力、提高骨骼密度、防治糖尿病等，但共轭亚油酸本身不太稳定，因此与维生素酯化不仅大大增强了维生素C的使用范围，也增强了共轭亚油酸的稳定性，使产品的附加值大大提高。目前实现这一“嫁接”有化学法和生物酶法，由于化学法存在转化条件苛刻(强酸、碱催化、高温高压)、无特异性、产物复杂、副产物多、分离难、安全性差等弊端，生物酶法越来越受青睐。脂肪酶是目前维生素酯合成中使用最广泛的酶，但是生产成本高、固定化过程繁杂费时大大局限了其商业化应用。
技术实现思路
本专利技术提供了一种酵母展示脂肪酶催化合成L-抗坏血酸共轭亚油酸酯的方法， 可显著降低L-抗坏血酸共轭亚油酸酯生产成本，同时达到较高的酯化反应效率和产率。一种酵母展示脂肪酶催化合成L-抗坏血酸共轭亚油酸酯的方法，包括将L-抗坏血酸和共轭亚油酸溶于有机溶剂中，加入酵母展示脂肪酶，无氧条件下于50 60°C反应4 8小时，分离、纯化制得L-抗坏血酸共轭亚油酸酯。优选的，所述的有机溶剂为正己烷和四氢呋喃的混合物，体积比优选为1 1。优选的，每升有机溶剂中L-抗坏血酸、共轭亚油酸和酵母展示脂肪酶的加入量分别为 15 35g、100 300ml,50 IOOgo搅拌速率为200 250转/分钟。优选的，在分离纯化前加入分子筛，继续搅拌反应10 12h，锁住水分，促进酯化反应进一步进行。所述的分离、纯化为离心取上清液，旋转蒸发除去有机溶剂，水洗后溶于正己烷，重结晶。所述的酵母展示脂肪酶通过如下方法制备将经线性化处理的重组质粒转入毕赤酵母(Pichia paStoriS)GS115，将所得转化子接种于BMMY培养基中，诱导培养72 144小时后离心收集菌体，菌体经冲洗、生物印迹和冷冻干燥制得酵母展示脂肪酶；所述的重组质粒由原始载体pPIC9K和依次插入原始载体PPIC9K中MF α 1信号肽下游的脂肪酶基因和毕赤酵母GS115的细胞壁α凝集素基因组成。所述的脂肪酶基因可选用Genbank号为AF229435的序列，毕赤酵母(Pichia paStoriS)GS115为商业化产品，可从^witrogen公司购得。它的细胞壁α凝集素基因序列的 Genbank 号为]\C8164。载体PPIC9K为商业化产品(如hvitrogen公司)，它存在MF α 1信号肽序列(Genbank号Μ17301)，同时该载体内信号肽序列上游存在AOXl启动子(Genbank号 Ζ46233)。重组质粒线性化处理的目的是为了与胞内基因组发生同源重组，提高表达稳定性。优选的，所述生物印迹所用配体为油酸，它可以诱导酶结构改变，提高转化率。本专利技术通过将脂肪酶基因和细胞壁α凝集素基因导入毕赤酵母细胞GS115，毕赤酵母细胞诱导培养后，脂肪酶表达并分泌到胞外，同时利用细胞壁α凝集素将该脂肪酶固定在细胞表面。利用该酵母展示脂肪酶对酯化反应进行催化，不仅提高了操作稳定性、耐热性以及重复性，而且反应产物单一(为6-0-conjugated linoleoyl-L-ascorbic acid)，转化率(以L-抗坏血酸计)在90%以上，产率高达88%。具体实施例方式实施例1制备酵母展示脂肪酶通过人工合成的方法，合成米根霉(lihizopus oryzae)的脂肪酶基因(Genbank 号AF229435)和毕赤酵母GS115的细胞壁α凝集素基因(Genbank号为Μ28164)，同时在脂肪酶基因C端加上连接肽序列GSSGGSGGSGGSGGSGS (linker)，连接后得到核苷酸序列 pro-ROL-linker-α -agglutinin,同时在序列两端添加EcoR I和Not I酶切位点，其中 pro-ROL为脂肪酶基因，α-agglutinin为细胞壁α凝集素基因。以上述人工合成序列为模板，利用下述引物对，进行PCR扩增，上游引物5，-AAGGAAAAAAGAATTCGTTCCAGTTTCTGG-3，；下游引物5，-TTTTCCTTTTGCGGCCGCTAATGAAACG-3，PCR反应体系为模板DNA为1 μ 1，高保真DNA聚合酶0. 5 μ 1，dNTP (50mM) 0. 4 μ 1， 上下游引物各0. 5 μ 1，10XPCR缓冲液5 μ 1，加水至50 μ 1。PCR运行条件为94°C 3分钟，；35个循环(94°C 30秒，60°C 1分钟，72°C 30秒)， 72 0C 10 分钟。用EocR I和Not I同时酶切PCR产物和pPIC9K质粒，并在T4连接酶的作用下过夜连接形成PPIC9K-R0L质粒，通过电泳检验并回收质粒。为使目的基因与毕赤酵母GS115 发生His 4单位点置换重组，用Ml I对pPIC9K-R0L质粒进行酶切线性化处理。将酶切线性化处理好的目的基因约15 μ 1加入到事先准备好的毕赤酵母GS115感受态细胞中，转入电转杯中，冰浴15min，然后在1500V，400Q，25uF条件下电击10ms，并加入约Iml预冷的山梨醇。将上述混勻的电转产物约400μ 1涂于MD平板上，筛选阳性转化子，然后将阳性转化子涂于不同浓度的G418平板上，根据阳性转化子对G418的抗性筛选出Mut表型的多拷贝阳性重组菌株。将多拷贝阳性重组菌株接种在BMGY培养基中发酵培养30h，离心收集细胞；再将细胞置于含有0.5% (体积百分比)甲醇的BMMY培养基中诱导培养144h，离心收集细胞， 用水冲洗后，接种至YGC培养基中30°C培养120h，然后3000g离心分钟收集菌体，蒸馏水洗涤后再用50mM pH7. 0磷酸缓冲液洗涤，然后与2倍体积油酸混合，-80°C下预冻后再经德国 Christ真空冷冻干燥机干燥Mh，用己烷洗涤除去油酸，再进行再真空干燥去除己烷，即得到经生物印迹处理的酵母展示脂肪酶。实施例2酵母展示脂肪酶催化合成L-抗坏血酸共轭亚油酸酯实例1取L-抗坏血酸0. 176g、共轭亚油酸1. anl，加入含有5mL正己烷和5mL四氢呋喃的磨口三角瓶，混合、预热lOmin，然后加入酵母展示脂肪酶0. 5g，充队密封，置于85_1 型磁力搅拌器中搅拌开始反应，转速为250转本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种酵母展示脂肪酶催化合成Ｌ－抗坏血酸共轭亚油酸酯的方法，包括：将Ｌ－抗坏血酸和共轭亚油酸溶于有机溶剂中，加入酵母展示脂肪酶，无氧条件下于５０～６０℃反应４～８小时，分离、纯化制得Ｌ－抗坏血酸共轭亚油酸酯；所述的酵母展示脂肪酶通过如下方法制备：将经线性化处理的重组质粒转入毕赤酵母（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＧＳ１１５，将所得转化子接种于ＢＭＭＹ培养基中，诱导培养７２～１４４小时后离心收集菌体，菌体经冲洗、生物印迹和冷冻干燥制得酵母展示脂肪酶；所述的重组质粒由原始载体ｐＰＩＣ９Ｋ和依次插入原始载体ｐＰＩＣ９Ｋ中ＭＦα１信号肽下游的脂肪酶基因和毕赤酵母ＧＳ１１５的细胞壁α凝集素基因组成。
【技术特征摘要】
1.一种酵母展示脂肪酶催化合成L-抗坏血酸共轭亚油酸酯的方法，包括将L-抗坏血酸和共轭亚油酸溶于有机溶剂中，加入酵母展示脂肪酶，无氧条件下于 50 60°C反应4 8小时，分离、纯化制得L-抗坏血酸共轭亚油酸酯；所述的酵母展示脂肪酶通过如下方法制备将经线性化处理的重组质粒转入毕赤酵母(Pichia paSt0riS)GS115，将所得转化子接种于BMMY培养基中，诱导培养72 144小时后离心收集菌体，菌体经冲洗、生物印迹和冷冻干燥制得酵母展示脂肪酶；所述的重组质粒由原始载...
【专利技术属性】
技术研发人员：阮晖，徐娟，地里热巴，周陈伟，王睿之，林吉恒，何国庆，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：86
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