一种猪瘟病毒和猪蓝耳病病毒的双色荧光定量PCR联合检测方法及其试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种猪瘟病毒和猪蓝耳病病毒的双色荧光定量PCR联合检测方法，该方法可以实现在同一个待测样本中同时检测猪瘟病毒和猪蓝耳病毒的存在，并能对两种病毒的负载水平进行定量。本发明专利技术还提供了一种用于猪瘟病毒和猪蓝耳病病毒双色荧光定量PCR联合检测的试剂盒。本发明专利技术的检测方法及试剂盒操作简便快速，特异性高，检测效果敏感、可靠，最低检测浓度为1×102拷贝/μl。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种猪瘟病毒和猪蓝耳病病毒的检测方法，具体涉及一种猪瘟病毒和猪蓝耳病病毒双色荧光定量PCR联合检测方法，进一步涉及一种猪瘟病毒和猪蓝耳病病毒的双色荧光定量PCR联合检测试剂盒。
技术介绍
猪瘟是由猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus, CSFV)引起的一种高度接触性热性传染病，该传染性高，致病性强，猪是本病唯一的自然宿主，感染的病猪主要表现为特征性病理变化，内脏出血，梗塞和坏死，死亡率很高，给养猪业造成重大的经济损失。 病猪是最主要的传染源，易感猪与病猪的直接接触是病毒传播的主要方式。在我国，猪瘟流行呈现典型猪瘟和非典型猪瘟共存、持续感染与隐性感染共存、免疫耐受和带毒综合征共存等形式；在国外，比利时、德国、荷兰最近爆发猪瘟也说明猪瘟流行形式发生了改变。 猪瘟新的流行形式给全世界养猪业提出了新的挑战。CSFV与牛病毒性腹泻病毒(bivine viral disease virus, BVDV)禾口羊边界病毒(border disease virus, BDV)同属黄病毒禾斗 (Flaviviridae)瘟病毒属(pestivirus)。猪瘟病毒基因组为单股正链RNA长约12. 3KB， 含有一个大的开放阅读框架。病毒粒子呈球形，直径40-50nm，二十面体对称，其芯髓直径四-30歷，有囊膜。猪蓝耳病即猪繁殖与呼吸综合征，是由猪蓝耳病病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus，PRRSV)引起的一种高度接触性传染病，在大多数国家中呈流行性感染。猪发病后临床表现差异极大，是该病的显著特征之一。临床症状主要是繁殖障碍，包括怀孕后期流产、早产和死胎，育成猪的呼吸道症状。发病母猪体温升高，厌食， 部分患猪的背侧、双耳的耳尖及边缘呈红蓝色。发病公猪性欲减退，生产性能下降。发病仔猪出生时死亡或产出后个体小。患猪死亡后的主要病理变化是眼球肿胀突出，头、臀部皮下水肿，胸腔、心包积水，心室扩张，心肌变化萎缩，肾脏皮质部点状出血，肺脏呈间质性肺炎病变。1991年病原首次鉴定，病毒是单链RNA病毒，属于动脉炎病毒科动脉炎病毒属，但是病毒的来源并未确定。1985年美国猪群猪繁殖与呼吸综合征病毒血清抗体的存在说明该病毒在发病之前就已经存在。常规的猪瘟病毒和猪蓝耳病病毒的实验室检验方法是根据免疫反应原理，利用 ELISA及双夹心ELISA法进行检测。目前，国内外已对猪瘟的结构蛋白基因进行了详尽的研究，国外有学者分别对CSFV Alfort株和Brescia株基因进行了全序列测定，并通过免疫学方法证明囊膜糖蛋白El是CSFV诱导保护性中和抗体的重要抗原，而国内则对于石门株 (shimen)的基因序列进行了测定。通过RT-PCR技术将编码相应结构蛋白的mRNA反转录成 cDNA，转入载体进行表达，并将表达产物进行纯化、定量以及作为抗原包板做ELISA进行感染检测。另外猪瘟兔化弱毒E2蛋白A/D区的高效表达和蛋白纯化后亦可以作为包被抗原进行ELISA测定，但是由于不能区分自然感染的和免疫接种。PRRSV可以从各种临床样品中分离到，包括血清、血浆、外周血单核细胞、骨髓、扁桃体、肺脏、淋巴结、胸腺、脾脏、心、 脑、肝、睾丸、附睾、输精管、尿道球腺、阴茎组织、口咽拭子、鼻甲、鼻拭子、胎盘、唾液、尿液、 粪便以及精液中。一般来说，肺脏深处积液以及血清都是病毒分离最理想的材料。送检材料通常应包括新鲜采集的肺、扁桃体以及淋巴结。但是只有当特定滴度的标准病毒在新巨噬细胞生长良好，方可使用。冰冻切片免疫荧光抗体试验(IFA)以及免疫组化试验(IHC) 可以检测组织中的PRRSV抗原。冰冻切片直接FA试验成本较低并且快速，这两种方法的特异性很高，但相对来说敏感性不够。样品的质量对FA结果影响非常大，要求组织应该新鲜。IHC可以检测甲醛固定的组织，比FA的敏感性要高，但更费时而且成本更高。通过组织病理学切片，结合IHC以及FA试验的结果可以对PRRSV感染做出准确的诊断。另外，针对上述两种病毒可以用RT-PCR技术进行检测。通常是用异硫氰酸胍-酚-仿一步抽提法提取病料细胞总RNA并进行反转录，再以此产物为模板对可疑的猪瘟或者猪蓝耳病病料进行了 PCR扩增。如果扩增出相应的片段则说明病毒的存在，敏感性要高于荧光抗体染色法、酶标单克隆抗体染色法和电镜负染法，可以作为一种有效的诊断方法。概括来说猪瘟病毒和猪蓝耳病病毒的检测方法主要包括免疫学检测方法和核酸检测方法两大类。免疫学方法主要是检测血清中是否存猪瘟和猪蓝耳病病毒的特异性抗体，具体是用ELISA的方法进行检测，然而这种方法必须是建立在已经发生病毒感染并产生抗体的基础上，而且鉴于上述病毒的高度变异性以及与其他病毒血清学的交叉性，其特异性难以保证，容易出现假阳性和假阴性。病毒分离和培养法比较敏感，但是这种方法操作繁琐，不宜在所有检测实验特别是一些基层实验室推广。用普通PCR的方法进行猪瘟或者猪蓝耳病病毒核酸，虽然灵敏度有所提高，但是容易产生非特异性扩增，甚至会因为操作的原因出现假阳性，而且普通PCR扩增法其结果的判断需要对产物进行凝胶电泳分析，操作方法不够简化。荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法，该方法操作方便快捷。CN101058830A公开了 “猪瘟病毒荧光定量RT-PCR诊断试剂盒”，CN101328506A公开了“一种特异检测猪瘟病毒野毒感染的荧光定量PCR快速诊断试剂盒及其应用方法”。两篇文献均只对猪瘟病毒进行了单独检测。猪瘟和猪蓝耳病是严重危害猪的病毒性疾病，常以单独或混合感染的方式感染猪，发病率和死亡率都较高。目前针对猪瘟病毒和猪蓝耳病病毒感染的联合检测方法还未完善。多色荧光定量PCR技术是指在同一个荧光定量PCR扩增试验中同时扩增多个目的基因，而每个目的基因采用的不用波长的荧光探针进行检测。荧光标记的探针有多种，比如卩八1^1(、(^、服0、冊乂等，每种荧光标记的探针在PCR扩增过程中所产生的荧光信号不同。
技术实现思路
本专利技术提供了一种猪瘟病毒和猪蓝耳病病毒的双色荧光定量PCR联合检测方法， 该方法可以实现在同一个待测样本中同时检测猪瘟病毒(CSFV)和猪蓝耳病病毒(PRRSV) 的存在，并能对两种病毒的负载水平进行定量。本专利技术还提供了一种用于猪瘟病毒和猪蓝耳病病毒双色荧光定量PCR联合检测的试剂盒。本专利技术所采用的猪瘟病毒(CSFV)和猪蓝耳病病毒(PRRSV)的双色荧光定量PCR联5合检测方法，包括如下步骤(1)提取待测样品中的病毒RNA；(2)以得到的总RNA为模板，使用猪瘟病毒(CSFV)的上游引物CSFV-F :5，-AGCTCCCTGGGTGGTCTAAGT-3，(SEQ ID NO. 1)； 下游引物CSFV-R :5，-CCCTCGTCCACATAGCATCT-3，(SEQ ID NO. 2)； 荧光探针CSFV-P :5，-AGTTCGACGTGAGCAGAAGCCCACC-3，(SEQ ID NO. 3)禾口猪蓝耳病病毒(PRRSV)的上游引物:PRRSV-F本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种猪瘟病毒和猪蓝耳病病毒的双色荧光定量ＰＣＲ联合检测方法，包括如下步骤：（１）提取待测样品中的病毒ＲＮＡ；（２）以得到的总ＲＮＡ为模板，使用猪瘟病毒的上游引物：ＣＳＦＶ－Ｆ：５’－ＡＧＣＴＣＣＣＴＧＧＧＴＧＧＴＣＴＡＡＧＴ－３’（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．１）；下游引物：ＣＳＦＶ－Ｒ：５’－ＣＣＣＴＣＧＴＣＣＡＣＡＴＡＧＣＡＴＣＴ－３’（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．２）；荧光探针：ＣＳＦＶ－Ｐ：５’－ＡＧＴＴＣＧＡＣＧＴＧＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＣＡＣＣ－３’（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．３）和猪蓝耳病病毒的上游引物：ＰＲＲＳＶ－Ｆ：５’－ＧＧＡＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＡＧＡＣＴＣＴ－３’（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．４）；下游引物：ＰＲＲＳＶ－Ｒ：５’－ＣＡＣＣＴＣＣＡＡＣＣＴＣＡＡＴＴＴＴＡＣＣ－３’（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．５）；荧光探针：ＰＲＲＳＶ－Ｐ：５’－ＣＴＧＧＣＧＧＴＣＡＣＣＣＧＴＣＡＴＣＡＴＡＧＡＧ－３’（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．６）进行一步双色荧光定量ＰＣＲ，其中，猪瘟病毒和猪蓝耳病病毒的荧光探针报告基团不相同；（３）结果分析：反应结束后，根据待测样品的荧光Ｃｔ值判断待测样品是否为ＣＳＦＶ、ＰＲＲＳＶ阳性。...

【技术特征摘要】
1.一种猪瘟病毒和猪蓝耳病病毒的双色荧光定量PCR联合检测方法，包括如下步骤(1)提取待测样品中的病毒RNA；(2)以得到的总RNA为模板，使用猪瘟病毒的上游引物CSFV-F :5，-AGCTCCCTGGGTGGTCTAAGT-3，(SEQ ID NO. 1)；下游引物CSFV-R :5，-CCCTCGTCCACATAGCATCT-3，(SEQ ID NO. 2)；荧光探针CSFV-P :5，-AGTTCGACGTGAGCAGAAGCCCACC-3，(SEQ ID NO. 3)禾口猪蓝耳病病毒的上游引物PRRSV-F :5，-GGACACCAAGGGCAGACTCT-3，(SEQ ID NO. 4)；下游引物PRRSV-R :5，-CACCTCCAACCTCAATTTTACC-3，(SEQ ID NO. 5)；荧光探针PRRSV-P :5，-CTGGCGGTCACCCGTCATCATAGAG-3，(SEQ ID NO. 6)进行一步双色荧光定量PCR，其中，猪瘟病毒和猪蓝耳病病毒的荧光探针报告基团不相同；(3)结果分析反应结束后，根据待测样品的荧光Ct值判断待测样品是否为CSFV、 PRRSV阳性。2.根据权利要求1所述的一种猪瘟病毒和猪蓝耳病病毒的双色荧光定量PCR联合检测方法，其特征在于荧光定量PCR反应的反应体系总体积为25μ 1，组成如下双色荧光定量 PCR MIX 20μ1、反转录酶系 μ 、Taq酶系 μ 以及提取的猪瘟和猪蓝耳病病毒RNA或者阳性质控品或者阴性质控品3μ1 ；其中双色荧光定量PCR MIX中含有IOX双色荧光定量PCR buffer、dNTPS。3.根据权利要求2所述的一种猪瘟病毒和猪蓝耳病病毒的双色荧光定量PCR联合检测方法，其特征在于10X双色荧光定量PCR buffer中含有以下成分500m M Tris-HCl (pH8. 0)、50mM MgCl2,250mM KCl 以及 15%(v/v)的 DMSO。4.根据权利要求2所述的一种猪瘟病毒和猪蓝耳病病毒的双色荧光定量PCR联合检测方法，其特征在于所述双色荧光定量PCR MIX的组成为10X双色荧光定量PCR buffer 2. 5μ1CSFV-F (10μΜ) μ μ μ μ 0. 5μ1 0. 5μ1 μ 11. 5μ1 20. 0μ 1。5.根据权利要求1所述的一种猪瘟病毒和猪蓝耳病病毒的双色荧光定量PCR联合检测方法，其特征在于双色荧光定量PCR反应条件为93°C 2分钟，然后93°C 30秒，55 58 °C 45秒，采集荧光信号，40个循环。6.一种猪瘟病毒和猪蓝耳病病毒的双色荧光定量PCR联合检测试剂盒，包括如下成分病毒核酸提取液A...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏文康，温肖会，吕殿红，黄忠，周秀蓉，罗胜军，贾春玲，袁洁，温晓慧，钱钢锐，
申请(专利权)人：广东省农业科学院兽医研究所，
类型：发明
国别省市：81