一种双靶向作用的嵌合多肽及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种双靶向作用的嵌合多肽及其制备方法和应用。本发明专利技术的嵌合多肽包括具有以下特征的三段序列：序列１是从Ｎ端计起的前２０－８０个人溶菌酶蛋白的氨基酸序列；序列２是Ｅｘｅｎｄｉｎ－４蛋白的氨基酸序列；序列３是序列１和序列２的连接序列，包含凝血酶酶切位点和二肽基肽酶的酶切位点。本发明专利技术的制备方法可以是通过多肽合成技术合成或者通过构建包含编码所述嵌合多肽的的核苷酸序列的表达载体，在基因工程菌株中表达并纯化得到。本发明专利技术的嵌合多肽具有显著的抗ＡＧＥｓ和降血糖的双靶向活性，可以应用于制备抗ＡＧＥｓ和／或降低高血糖的药物。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及蛋白制多肽的制备及其应用领域，具体涉及一种包含人溶菌酶N端氨基酸序列和Exendin-4氨基酸序列的双靶向作用的嵌合多肽及其应用。
技术介绍
溶菌酶是一种存在于蛋清和身体分泌液(如唾液、泪液等)中、能有效水解细菌壁多糖的防御性酶。人溶菌酶由148个氨基酸残基组成，其结构如SEQ ID No1所示，其中靠近N-端约有18个氨基酸残基组成的结构域与晚期糖基化终产物(AGEs)具有高度亲和力，其解离常数Kd为50nM。体外实验发现溶菌酶能结合AGEs修饰的清蛋白，并促进单核巨噬细胞对AGEs的摄入。基于体内AGEs受细胞外酶降解的事实，科学家在实验糖尿病小鼠体内注入溶菌酶后，发现其血清AGEs水平显著降低，并减少细胞因子如IGF-1的产生，恢复系膜细胞的MMP-9表达水平，降低尿蛋白含量，尿中AGEs浓度升高达2倍，减少糖尿病并发症的发生，尤其对糖尿病性肾病的减缓效果，显示溶菌酶对于清除体内AGEs和防治糖尿病并发症具有显著的功效。最近美国的科学家研究发现，小鼠输入溶菌酶后，其血清和肝脏的AGEs含量显著减少，同时减少AGEs造成的氧化应激反应，还原型谷胱甘肽比例升高(GSH/GSSG)，小鼠的存活率比对照的高两倍，再次证明溶菌酶对于体内AGEs有对抗作用。然而，溶菌酶对体内AGEs的对抗作用与它的水解酶活性无关，此酶主要通过它的N端序列与AGEs结合，进而促进后者的清除，包括被细胞吞噬和水解酶的水解，其水解产物(小分子AGEs)经过肾脏从尿中排出体外。最近的实验证明，溶菌酶N端约77个氨基酸组成的序列(多肽)对AGEs具有很高的结合活性，能在体外实验中有效地结合AGEs分子，但这个多肽并没有溶菌酶的水解酶活性，说明溶菌酶的N端片段可能具有溶菌酶全酶的抗AGEs活性，包括促进体内AGEs的清除和排泄。另外，在生产溶菌酶蛋白的技术上，当应用基因工程技术利用原核细菌生产溶菌酶时，因产物溶菌酶蛋白对工程菌的破坏作用，大大影响了产量的提高，因此，用溶菌酶的部分基因构建的原核表达载体，只生产溶菌酶的N端片段，将有利于大量生产上述的具有抗AGEs活性的溶菌酶片段。 AGEs是一类非酶催化的糖基化产物。体内的葡萄糖、果糖、6-磷酸葡萄糖等还原糖的醛基与蛋白质、脂质或核酸等生物大分子的氨基形成Schiff碱，再经过分子重排生成早期糖基化产物--Amadori产物，后者经过一系列非酶促反应包括氧化、脱水、分子重排等变成不可逆的AGEs。由于AGEs具有很强的反应活性(如形成分子间交联)以及对蛋白水解酶的抵抗性等特点，生物大分子一经形成AGEs加合物后即严重影响甚至丧失其生物学活性，如AGEs使胶原分子异常交联而降低其转换率，导致组织老化及血管弹性降低，DNA经AGEs修饰后导致基因突变，AGEs修饰LDL而影响后者与LDL受体结合，造成它的清除率减慢等。同时，AGEs还通过与细胞膜上的受体结合，促进细胞因子如IL-6，粘附分子如VCAM-1，ICAM-1，及生长因子如PDGF，IGF-1的产生和分泌，造成炎症反应和组织损伤。 正常人体内缓慢地产生少量AGEs，其生成与清除处于一定平衡。随着年龄增加，体内AGEs水平逐渐升高，因而AGEs被认为是引起组织器官衰老的重要因素之一。糖尿病患者由于长期处于高血糖水平，体内AGEs的生成异常增加，AGEs的大量堆积导致一系列病理变化，如血管壁基底膜增厚、弹性降低、通透性增高、管腔变狭窄，细胞外基质分子结构与组成改变，以及炎症因子的产生和释放等，这些变化是造成糖尿病慢性并发症如糖尿病性肾病、糖尿病性脑病、白内障、糖尿病性心血管病等的主要原因。同时，老年患者因体内AGEs含量升高，可导致一些老年性精神障碍疾病的发生，如阿尔茨海默病(老年痴呆症)、脑血管病所致精神障碍、血管性痴呆等。因此，控制或降低体内AGEs的水平，能延缓组织器官衰老、预防或减轻糖尿病慢性并发症的发生和发展。 Exendin-4(一种肠促胰岛素拟似物)是从一种蜥蜴的唾液腺毒素中分离出来的由39个氨基酸组成的多肽，其结构如SEQ ID No2所示。Exendin-4是一种胰高血糖素样肽-1(GLP-1)受体的长效激动剂，它与GLP-1具有53％的序列同源性，具有促进葡萄糖依赖性的胰岛素合成和分泌的作用，与GLP-1相比，exendin-4的降血糖作用更强。目前其人工合成多肽exenatide(商品名Byetta)已被用于临床糖尿病治疗。近年来，Exendin-4作为治疗2型糖尿病的新型药物广泛引起人们的关注，而Exenatide作为首个获准的肠降血糖类似物，于2005年4月获美国食品与药物管理局(FDA)批准用于二甲双胍、磺脲类药物血糖控制不理想的糖尿病患者的治疗，2007年5月在英国也成为一种有效的降糖药。 多肽药物是近年来生物医药研究的成果之一，多肽药物的生产主要有化学合成法和基因工程生产法。化学合成法主要是固相或液相合成法。固相合成技术目前已较为成熟，但成本较高，随着基因工程技术的成熟，国内外都尝试用基因工程技术生产多肽以提高产量，降低成本。用基因工程方法生产中等长度(20-60个氨基酸残基)多肽时，由于表达水平低，且容易降解，因此常与其他载体蛋白融合表达。但由于目的多肽在融合蛋白中所占比例很小，裂解后分离纯化困难，影响了基因工程生产多肽药物的发展。另一解决途经就是把目的多肽的基因串联，可以提高产量。但串联体切割时需要大量的酶，间接增加了生产成本。近年来，随着基因工程技术的进展，构建各种融合蛋白或单体、串联体多肽的报道迅速增加。然而，利用人体自身存在的酶，在体内对多肽药物进行裂解并缓慢释放其有效成分，使之成为可在体内产生两种多肽而发挥不同效应并达到治疗同一种疾病的多肽药物，尚未见报道。 综上所述，溶菌酶能有效地发挥抗AGEs作用，促进AGEs的清除与排泄，主要是因为其对AGEs分子有结合作用，与溶菌酶的水解作用无关。所以，溶菌酶的N端序列是结合AGEs的部分，具有抗AGEs的药用功能。Exendin-4是一种比GLP-1更有效、作用时间更长的降糖物质。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术的目的是提供一种既能抗AGEs又能改善高血糖并对AGEs或高血糖引起的疾病具有防治作用的一种双靶向作用的嵌合多肽及其应用。 本专利技术的目的通过以下的技术方案实现一种双靶向作用的嵌合多肽，包括具有以下特征的三段序列序列1是人溶菌酶蛋白从N端计起的前20-80个氨基酸序列，也即从人溶菌酶N端第一个氨基酸残基算起的20-80个氨基酸序列；序列2是Exendin-4蛋白的氨基酸序列；序列3是序列1和序列2的连接序列，包含凝血酶酶切位点和二肽基肽酶的酶切位点。 所述二肽基肽酶的酶切位点位于与Exendin-4蛋白的氨基酸序列相接的一侧。 所述溶菌酶蛋白的氨基酸序列包括已发表的各种人源性溶菌酶N端氨基酸序列。 所述溶菌酶蛋白的氨基酸序列优选SEQ ID No1的序列 所述Exendin-4蛋白的氨基酸序列已在NCBI网站登记，序列号为AAB22006，具体序列如SEQ ID No2所示。 所述嵌合多肽的结构示意图见图1。 本专利技术提供了所述双靶向作用的嵌合多肽的制备方法，通过本领域公知多肽合成技术合成；本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种双靶向作用的嵌合多肽，其特征在于包括具有以下特征的三段序列：序列１是从Ｎ端计起的前２０－８０个人溶菌酶蛋白的氨基酸序列；序列２是Ｅｘｅｎｄｉｎ－４蛋白的氨基酸序列；序列３是序列１和序列２的连接序列，包含凝血酶酶切位点和二肽基肽酶的酶切位点。

【技术特征摘要】
1.一种双靶向作用的嵌合多肽，其特征在于包括具有以下特征的三段序列序列1是从N端计起的前20-80个人溶菌酶蛋白的氨基酸序列；序列2是Exendin-4蛋白的氨基酸序列；序列3是序列1和序列2的连接序列，包含凝血酶酶切位点和二肽基肽酶的酶切位点。2.根据权利要求1所述的双靶向作用的嵌合多肽，其特征在于所述二肽基肽酶的酶切位点位于与Exendin-4蛋白的氨基酸序列相接的一侧。3.根据权利要求1所述的双靶向作用的嵌合多肽，其特征在于所述溶菌酶蛋白的氨基酸序列包括已发表的各种人源性溶菌酶N端氨基酸序列。4.根据权利要求3所述的双靶向作用的嵌合多肽，其特征在于所述溶菌酶蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No1所示。5.根据权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘誉，谢琪璇，
申请(专利权)人：暨南大学，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]