使用蛋白酶活化的受体鉴别调节蛋白质-蛋白质相互作用的分子制造技术

分析方法和体系利用蛋白质-蛋白质相互作用所导致的酶切割来调节(激活或失活)报道分子。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用蛋白酶活化的受体鉴别调节蛋白质-蛋白质相互作用的分子专利
本专利技术涉及用于确定所研究分子间相互作用的材料和方法。更具体地说，本专利技术涉及确定某特定物质例如一种“受试化合物”是否能调节所研究的两个或两个以上特定蛋白质之间的相互作用。确定蛋白质之间相互作用涉及监测报道分子的活化，该报道分子可存在于细胞中、溶液中，或存在于含有一种或多种所研究反应物的人工包装或单元中，其中报导基的因激活与否取决于调节作用是否发生。这种确定一般是利用转化或转染的细胞而实现的。这些转化或转染细胞以及用于转化或转染细胞的试剂，也是本专利技术的一个方面。此外，还可采用一种无细胞体系，或一种利用携带一种或多种所研究试剂的人工包装或单元如病毒、病毒样颗粒、脂质体等的体系。专利技术背景和相关技术通过受体配体的鉴别而对蛋白质-蛋白质相互作用进行研究是一个令人很感兴趣的领域。即使某一特定受体的一个或多个配体是已知的，人们仍希望能鉴别出更有效或更具选择性的配体。本文将把G-蛋白偶联受体GPCR，又称为七跨膜受体(7TMR)，作为一类可以这种方式表征的蛋白质的非排它性实例而进行讨论。但是，任何能够相互作用的蛋白质，如一个代谢途径或一个级联的成员，均适用于本分析方法。GPCR是人类已知的最大一类细胞表面受体，因此被认为是本专利技术的主要应用对象。调节GPCR信号的配体包括激素、神经递质、肽、糖蛋白、脂质、核苷酸和离子。GPCR也已知为感觉受体，例如光觉、嗅觉、信息素和味觉的受体。由于GPCR具有如此众多和多样化的作用，它们是许多积极研究的对象，例如，化学战防御和生物战防御应用方面的研究，以及用于治疗各种病症的药物方面的研究。业已成功地发现许多药物。例如，Howard等人估计，50%以上的市售药物对这些受体起作用(Howard, et al. ,Trends Pharmacol. Sci. ,22 132140(2001))ο本文所用的“GPCR”系指GPCR受体超家族的任何成员。这一超家族的特征是具有一个七跨膜域(7TM)结构。这些受体的实例包括但不限于，A类或“视紫红质样”受体；B类或“促胰液素样”受体；C类或“代谢谷氨酸样”受体；Frizzled和Smoothened相关的受体；粘着受体家族或EGF-7TM/LNB-7TM受体；脂连蛋白受体和相关的受体；以及化学感觉受体，包括嗅觉、味觉、犁鼻和信息素受体。例如，人类的GPCR超家族包括但不限于下列文献所描述的受体分子:Vassilatis, et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100 4903 4908(2003) ；Takeda，et al. , FEBS Letters,520 97 101 (2002) ；Fredricksson, et al. , Mol. Pharmacol. ,63 :1256 1272(2003) ；Glusman, et al. , Genome Res. ,11 :685 702(2001)；以及 Zozulya, et al.，Genome Biol.，2 :0018. 1 0018. 12(2001)。简言之，GPCR功能的一般作用机制如下1)GPCR与配体结合，2)引起构象变化，从而3)激发导致细胞生理学变化的细胞事件级联。GPCR通过调节一批细胞内蛋白质，如异三聚体鸟嘌呤核苷酸结合蛋白(G蛋白)和β抑制蛋白(iiarrestins)的活性而转导信号。 在G蛋白的情况下，配体-受体复合物激发鸟嘌呤核苷酸的交换，并使G蛋白的异质三聚体解离为α和β Y亚基。在其它一些情况下，β抑制蛋白可取代G蛋白、抵制G蛋白信号转导、协同G蛋白信号转导等。业已观察到GTP结合的α亚基和β y异二聚体均可调节各种细胞效应蛋白，包括腺苷酰环化酶和磷脂酶C (PLC)。在常规的基于细胞的GPCR分析中，受体活性是通过测定 G蛋白调节的效应物通道的输出，如由腺苷酰环化酶产生的cAMP的积聚或由PLC活性刺激而导致的分子内钙的释放来监测的。由于种种原因，对于某些分析对象，很难研发出常规的基于G蛋白的信号转导分析方法。首先，例如，不同的GPCR与不同的G蛋白调节的信号转导途径偶联。常规的基于G 蛋白的分析方法依赖于对目标受体的G蛋白特异性的了解，或者此分析方法要求构建细胞体系，迫使目标受体与选定的G蛋白效应物途径偶联。其次，由于GPCR超家族是如此之大， 所有细胞都表达许多内源的GPCR(以及其它受体和信号传递因子)。因此，除了目标GPCR 之外，测得的效应物途径也能被内源分子调节。这一现象可能导致假阳性或假阴性结果，例如在试图鉴别目标GPCR的选择性调节剂时即是如此。G蛋白活性的调节并不是配体/GPCR结合的唯一结果。参阅如Luttrell，et al., J. Cell Sci.，115 :455465(2002)，以及 Ferguson，Pharmacol. Rev. ,53 :124(2001)。这些文献评述了一些可能导致GPCR信号衰减或终止的活动。这些终止过程对于防止细胞过度刺激以及在细胞外信号和相应细胞内途径之间强制建立一种暂时的连接是很有用的。一般而言，激动剂与GPCR的结合将导致该受体分子C端的丝氨酸和苏氨酸残基在 GPCR激酶的作用下发生磷酸化。络合了激动剂的C端磷酸化的GPCR的激动剂然后与抑制蛋白家族成员如α抑制蛋白、β抑制蛋白或β抑制蛋白2相互作用，这些抑制蛋白下调或抑制受体信号转导。这一结合能抑制受体与G蛋白的偶联，从而使受体发生内化，然后降解和/或再循环。例如，抑制蛋白的结合，如β抑制蛋白2与磷酸化GPCR的结合，可以不同的方式降低目标GPCR的活性。抑制蛋白抑制其目标活化的最简单机制就是与GPCR的胞内域结合，从而阻断异三聚体G蛋白的结合位点并防止细胞外信号激活信号途径(脱敏作用)。抑制蛋白使用的另一种调节机制是使受体与膜内化机构的元件相连(如网格蛋白介导的内吞作用)，这将引起受体在被膜小泡中内化而与核内体融合。一旦到达核内体，该受体即可被(例如溶酶体)降解，或可再循环至质膜，在此再次被激活。因此，可以说，配体与GPCR的结合“调节” 了 GPCR和抑制蛋白之间的相互作用，因为配体与GPCR的结合导致了抑制蛋白与GPCR的结合，籍此调节其活性。在本文中，当述及相互作用或结合的时候，“调节”或其任何其它形式只是指本专利技术的两个蛋白质之间相互作用方式的某些变化，例如，在一种受试化合物或配体存在与不存在的情况下，比较这两个蛋白质之间如何相互作用。因此，调节仅包括两个分子的结合。例如，受试化合物的存在可能以某种可检测的方式或形式加强或增强、减弱、阻断、抑制、改向、降低或改变两个蛋白质之间的相互作用，或者受试化合物可促进相互作用的可能性等。在某些情况下，7TMR信号转导的发生可独立于G蛋白。因此，当配体与7TMR结合时，是β抑制蛋白而不是G蛋白被募集参与或引发细胞中的信号级联放大。参阅如Violin & Lefkowitz，Trends Pharm Sciences28 (8)416—422，2007 禾口 DeFea，Br J Pharm 1-12, doi :10. 1038/si. bjp. 0707508，本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种鉴定调节第一蛋白质和第二蛋白质之间相互作用的化合物的方法，该方法包括：ｉ）提供与一种非活性报道分子活化蛋白质连接的第一蛋白质以及与一种蛋白酶连接的第二蛋白质，其中所述蛋白酶能够切割所述报道分子活化蛋白质中的切割位点，从而活化所述报道分子活化蛋白质：ｉｉ）提供所述化合物，以及任选地报道分子；ｉｉｉ）允许所述蛋白酶切割所述切割位点；以及ｉｖ）监测来自所述活化的报道分子活化蛋白质或所述报道分子的报道分子信号，所述报道分子的信号被所述报道分子活化蛋白质的活性改变；其中报道分子信号的改变表明发生了所述蛋白质－蛋白质相互作用。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2007.09.04 US 60/969,756;2008.07.30 US 61/084,9871.一种鉴定调节第一蛋白质和第二蛋白质之间相互作用的化合物的方法，该方法包括i)提供与一种非活性报道分子活化蛋白质连接的第一蛋白质以及与一种蛋白酶连接的第二蛋白质，其中所述蛋白酶能够切割所述报道分子活化蛋白质中的切割位点，从而活化所述报道分子活化蛋白质 )提供所述化合物，以及任选地报道分子；iii)允许所述蛋白酶切割所述切割位点；以及iv)监测来自所述活化的报道分子活化蛋白质或所述报道分子的报道分子信号，所述报道分子的信号被所述报道分子活化蛋白质的活性改变；其中报道分子信号的改变表明发生了所述蛋白质-蛋白质相互作用。2.权利要求1所述的方法，其中所述报道分子活化蛋白质是一种报道分子。3.权利要求1所述的方法，其中第一蛋白质与所述报道分子活化蛋白质形成融合蛋白。4.权利要求1所述的方法，其进一步包括提供一种已知调节蛋白质-蛋白质相互作用的分子，其中所述化合物调节所述分子与所述蛋白质-蛋白质相互作用的相互作用。5.权利要求1所述的方法，其中所述报道分子活化蛋白质是酶。6.权利要求1所述的方法，其中所述报道分子活化蛋白质是引起报道分子荧光变化的蛋白质。7.权利要求1所述的方法，其中所述第一蛋白质是一种膜蛋白质。8.一种分析体系，其包括i)包含潜伏报道分子活化蛋白质的第一蛋白质；以及 )包含蛋白酶的第二蛋白质；以及任选地iii)报道分子，其信号被所述报道分子活化蛋白质改变；其中所述潜伏报道分子活化蛋白质是通过所述蛋白酶引起的切割而激活的，并且所述第一蛋白质与第二蛋白质的缔合允许所述报道分子活化蛋白质发生切割。9.权利要求8所述的体系，其中所述报道分子活化蛋白质是所述报道分子。10.权利要求8所...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡济东，P·S·怀特，P·韦森瑟，H·埃辛德雷罗，
申请(专利权)人：塞诺菲安万特股份有限公司，
类型：发明
国别省市：FR