本发明专利技术涉及一种利用RNA恒温扩增的结核分枝杆菌核酸检测试剂盒，试剂盒包含TB稀释液、TB反应液、TB检测液、SAT酶液、TB阳性对照、TB阴性对照；结核分枝杆菌经液化处理后通过加药培养和不加药培养，利用两种方法培养后的结核分枝杆菌之间存在的差异，利用免疫共沉淀或NaOH再处理两种培养后的结核分枝杆菌菌液，并对处理后的菌液进行SAT检测，根据检测结果来分析结核分枝杆菌的耐药性。本发明专利技术能简单有效的对结核分枝杆菌耐药性进行分析，简便，省时。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及核分枝杆菌TB体外分子生物法检测领域，特别是涉及一种利用RNA恒温扩增的结核分枝杆菌核酸检测试剂盒。
技术介绍
结核分枝杆菌(M. Tuberculosis, TB)是人及动物结核病(tuberculosis)的病原菌，属于放射菌目分枝杆菌科分枝杆菌属。可以分为人型、牛型、鸟型、鼠型、冷血动物型和近年来发现的非洲型。对人类致病的主要为人型，牛型杆菌较少见，鸟类杆菌更少见，非典型分枝杆菌也可引起类似结核样病变，但少见。前三型由于发现的较早，已经在1901年伦敦国际结核病会议以后得到完全确认，被称为经典结核杆菌。对人畜威胁最大的正式经典结核杆菌。结核杆菌为细长或微弯曲的杆菌，长1 4 μ m，宽0. 2 0. 5 μ m，呈单个或分枝状排列，无荚膜、无鞭毛、无芽胞。在陈旧的病灶和培养物中，形态常不典型，可呈颗粒状、串球状、短棒状、长丝型。牛型菌比人型菌较短而粗。禽型菌具有多型性，有时呈杆状或链球状等。结核杆菌为专性需氧菌。营养要求高，在含有蛋黄、马铃薯、甘油和天门冬素等的固体培养基上才能生长。生长条件以37 37. 5度、pH为6. 5 6. 8最适合，生长缓慢，在固体培养基上需要2 8周才出现肉眼可以看见的菌落。目前对结核病诊断主要依靠实验室诊断与临床体症相结合。实验室诊断主要包括涂片检查、培养法、抗原抗体检测、PCR和TMA等。1.细菌学方法涂片镜检法将待检测或者预处理的标本涂于玻片上，固定后进行染色，待干后进行镜检。抗酸杆菌阴性(_)连续观察300个不同视野，未发现抗酸杆菌。抗酸杆菌阳性——报告抗酸杆菌菌数1 8条/300视野——抗酸杆菌阳性⑴3 9条/100视野—抗酸杆菌阳性(++):1 9条/10视野——抗酸杆菌阳性(+++) :1 9条/每视野——抗酸杆菌阳性(++++)彡10条/每视野痰涂片直接镜检是检测抗酸杆菌(AFB)最普遍的实验室诊断方法，特异性较高， 但灵敏性较低，涂片中分枝杆菌要达到103 104CFU/ml才可检测出阳性结果，且仅能检出 1/2-3/4的活动性结核患者，漏检率相当高。培养法取消化后的痰液混勻，用无菌吸管接种在培养基斜面，接种后斜面向上于 37°C恒温培养箱内，每周观察细菌生长情况，阳性生长者经涂片萋-尼氏染色法验证后随时报告结果，培养至8周仍未见细菌生长者，报告分枝杆菌阴性。罗氏(LChvenstein Jensen)培养法是目前检测MTB的“金标准”，但其检测周期长 (8周)，导致无法及时确诊结核患者，并无法及时治疗。2.免疫学方法结核菌素皮肤试验(tuberculin skin test,TST)结核菌素通常是指旧结核菌素 (OT)和结核菌纯蛋白衍生物(PPD)，常用于结核病流行病学调查、结核菌感染情况监测、卡介苗接种前试验、结核病辅助诊断。MTB在体内感染主要引起细胞介导的免疫反应，一直是筛选结核分枝杆菌潜伏感染的重要方法，已被应用多年，并得到广泛的承认，虽然此方法在世界范围内应用的非常广泛，但是从灵敏度和特异性来说，它不是一个理想的检测方法。为预防结核而接种卡介苗的人群，将会对PPD产生假阳反应。结核病的免疫学机制主要是机体对结核分枝杆菌所引起的细胞免疫反应。人体初次感染结核分枝杆菌后使T淋巴细胞致敏转化为记忆T淋巴细胞，当人体再次接触结核分枝杆菌后，机体会迅速产生效应T淋巴细胞并产生多种细胞因子发挥免疫效应，其中干扰素(IFNl)是最为关键的细胞因子。因此，检测IFN-y水平或分泌IFN-I的效应T细胞的水平就可以判断是否存在结核感染。ELISA方法近年来血清学方法检测结核抗体倍受国内外学者关注。结核诊断尤其是菌阴性结核病诊断仍是结核病防治中亟待研究和解决的问题。目前结核抗体仍是活动性结核病，特别是菌阴性结核病和肺外结核病诊断中的重要辅助诊断手段。由于结核患者免疫功能、遗传背景和接受的治疗不同而导致对MTB抗原识别的差异以及结核患者对抗原的识别存在阶段特异性，目前任何一个单一的抗原或商品化的组合抗原检测试剂盒都无法检测出所有结核患者血清中的抗结核抗体，筛选MTB特异性抗原，组成联合抗原是目前血清学诊断的研究方向。目前结核杆菌抗体的检测大部分采用ELISA方法，ELISA方法具有简单、低廉的特点，但目前许多方法还不太成熟，在特异性和灵敏度方面有待提高。随着结核分枝杆菌几种特异性抗原的发现与纯化，实验技术的不断改进，ELISA检测血清结核抗体已在国内临床实验应用，检测结核抗体有助于结核病的诊断和鉴别诊断。用ELISA检测结核分枝杆菌抗体操作简单、经济，是活动性肺结核的有效诊断方法。3.分子生物学法在分枝杆菌菌种鉴定、流行病学研究、基因组比较分析、耐药性监测等方面，分子生物学方法对结核病诊断和治疗起重要辅助作用，主要技术包括PCR、测序、指纹图谱、生物芯片、TMA等。PCR:是一种根据核酸复制原理采用分子技术模拟细胞内核酸复制过程的体外扩增技术，目前已发展出了巢式或套式PCR、多重PCR、逆转录PCR、嵌合荧光PCR等多种PCR技术，PCR技术与其它分子技术相结合产生的新兴技术更是层出不穷。1989年，Hance等最先报道将PCR技术应用于TB的检测，其突出特点是灵敏度高，可以检测出1 IOOfg纯化的分枝杆菌DNA，相当于1 20个MTB，与传统的痰涂片抗酸染色和培养方法相比，其敏感性得到了大大提高。此外，与传统检测方法相比，PCR检测的报告周期短，1 2天即可发出报告，因此对于TB的早期诊断具有独到的优势，但同时该方法存在的假阳性、标本中PCR抑制物质导致的假阴性等问题还有待进一步改进。TMA:采用转录介导的扩增技术对靶核酸进行扩增，采用化学发光物丫啶酯标记的 DNA探针与扩增的靶基因进行杂交，探针与扩增产物杂交后利用杂交保护试验去除未杂交的标记探针，最后利用化学发光仪检测化学发光信号。由于采用了转录介导扩增技术、杂交保护检测技术和化学发光等多种敏感的分子技术，具有高度的敏感性和特异性。研究表明 TMA对涂阳TB诊断的敏感性达到92 100%，对涂阴TB诊断的敏感性也可达40 93%， 对所有临床标本检测的特异性均在95%以上，因此具有极大的应用潜力。Gen-Probe公司的TMA检测试剂盒已获得美国FDA的批准应用于临床TB的诊断，不足之处在于操作较为复杂，技术不易掌握，且需要配套的化学发光检测仪，因而在临床的推广应用较为困难。本公司已申请了专利核酸恒温同步放大检测方法(Simultaneous Amplification andTestiTB, SAT)(申请号200810111479.0)；在此项技术的基础上，本专利技术结核分枝杆菌 (TB)核酸检测试剂盒采用的是SAT技术，核酸扩增使用M-MLV反转录酶和T7 RNA多聚酶来同时实现，反转录酶用于产生靶标核酸(RNA)的一个DNA拷贝，T7 RNA多聚酶从DNA拷贝上产生多个RNA拷贝，带有荧光标记的优化探针和扩增后产生的RNA拷贝特异结合，从而产生荧光，该荧光信号可由检测仪器捕获。该试剂盒能够检测痰液中的TBrRNA，具有特异性高、 灵敏度高和污染低(扩增产物RNA在自然环境下易于降解)的特点。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是克服现有技术特异性、灵敏性不高，实验污染不易本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种利用ＲＮＡ恒温扩增的结核分枝杆菌核酸检测试剂盒，包括：（１）ＴＢ稀释液：为含ＲＮａｓｅ抑制剂的灭菌ＤＥＰＣ水溶液；（２）ＴＢ反应液：为含ｄＮＴＰｓ和ＮＴＰｓ扩增所需组份，具体包含Ｔｒｉｓ １０～５０ｍＭ，ＭｇＣｌ２１０～４０ｍＭ，ｄＮＴＰ ０．５～５ｍＭ，ＮＴＰ １～１０ｍＭ，ＰＶＰ４０ １～１０％，ＫＣｌ ５～４０ｍＭ；（３）ＴＢ检测液：为恒温扩增时必需的ＴＢ引物和ＴＢ荧光探针溶解在ＴＥ溶液中配制而成，其中ＴＢ检测液中的引物和探针包含有以下一对或几对序列：ＴＢ Ｔ７：ａａｔｔｔａａｔａｃ ｇａｃｔｃａｃｔａｔ ａｇｇｇａｇａｃａｃ ｃａａｃａａｇｃｔｇ ａｔａｇｇｃｃｇｃｇ ｇ ａａｔｔｔａａｔａｃ ｇａｃｔｃａｃｔａｔ ａｇｇｇａｇａｇｔｃ ａｃｃｃｃａｃｃａａ ｃａａｇｃｔｇａｔａ ｇｇｃ ａａｔｔｔａａｔａｃ ｇａｃｔｃａｃｔａｔ ａｇｇｇａｇａｇｔａ ｇｇｃｃｇｔｃａｃｃ ｃｃａｃｃａａｃａａ ｇｃ ａａｔｔｔａａｔａｃ ｇａｃｔｃａｃｔａｔ ａｇｇｇａｇａｔｃａ ｃｃｃｃａｃｃａａｃ ａａｇｃｔｇａｔａｇ ｇｃ ａａｔｔｔａａｔａｃ ｇａｃｔｃａｃｔａｔ ａｇｇｇａｇａｇｔａ ｇｇｃｃｇｔｃａｃｃ ｃｃａｃｃａａｃａａ ｇｃｔｇａｔＴＢｎＴ７：ｇａｇｔｇｇｃｇａａ ｃｇｇｇｔｇａｇｔａ ａｃ ｇｃａａｇｔｃｇａａ ｃｇｇａａａｇｇｔｃ ｔｃ ｃｇｇｇｔｇａｇｔａ ａｃａｃｇｔｇｇｇｔ ｇａｔｃｔｇｃ ｃｔｇｇｇａａａｃｔ ｇｇｇｔｃｔａａｔａ ｃ ｇｔｇｇｃｇａａｃｇ ｇｇｔｇａｇｔａａｃＴＢ Ｐｒｏｂｅ：ｃｇｕｃｃｇｇａｕａ ｇｇａｃｃａｃｇｇｇ ａｃｇ ｃｃａｃｇｇａｕａｇ ｇａｃｃａｃｇｇｇａ ｕｇｃｇｕｇｇ ｃｃａｇｇａｕｇｃａ ｕｇｕｃｕｕｇｕｇｇ ｃｃｕｇｇ；（４）ＳＡＴ酶液：为恒温扩增时必需的多酶组分体系，含Ｔ７ ＲＮＡ聚合酶２００～２０００Ｕ／反应、Ｍ－ＭＬＶ反转录酶４００～４０００Ｕ／反应、２～１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、１０～１００ｍＭＮ－ａｃｅｔｙｌ－Ｌ－ｃｙｓｔｅｉｎｅ、０．０４～０．４ｍＭ ｚｉｎｃ ａｃｅｔａｔｅ、１０～１００ｍＭ ｔｒｅｈａｌｏｓｅ、４０～２００ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ ８．０、４０～２００ｍＭ ＫＣｌ、１～１０ｍＭ ＥＤＴＡ、２～２０％ ｖ／ｖ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、１０～４０％ ｖ／ｖ ｇｌｙｃｅｒｏｌ；（５）ＴＢ阳性对照；为含１０２～１０５ＣＦＵ／ｍｌ结核分枝杆菌的菌液；（６）ＴＢ阴性对照：为不含有ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ１４核酸序列或不含有结核分枝杆菌的的溶液。...
【技术特征摘要】
2010.05.25 CN 201010184457.41.一种利用RNA恒温扩增的结核分枝杆菌核酸检测试剂盒，包括(1)TB稀释液为含RNase抑制剂的灭菌DEPC水溶液；(2)TB反应液为含dNIPs和NIPs扩增所需组份，具体包含iTris10 50mM，MgCl2l 40mM, dNTP 0. 5 5mM，NTP 1 10mM，PVP40 1 10%，KCl 5 40mM ；(3)TB检测液为恒温扩增时必需的TB引物和TB荧光探针溶解在TE溶液中配制而成， 其中TB检测液中的引物和探针包含有以下一对或几对序列TB T7 :aatttaatac gactcactat agggagacac caacaagctg ataggccgcg gaatttaatac gactcactat agggagagtc accccaccaa caagctgata ggc aatttaatac gactcactat agggagagta ggccgtcacc C C3.C C3.3.C3.3. ^C aatttaatac gactcactat agggagatca ccccaccaac aagctgatag gc aatttaatac gactcactat agggagagta ggccgtcacc ccaccaacaa gctgatTBnT7 :gagtggcgaa cgggtgagta ac gcaagtcgaa cggaaaggtc tc cgggtgagta acacgtgggt gatctgc ctgggaaact gggtctaata c gtggcgaacg ggtgagtaacTB Probe :cguccggaua ggaccacggg acgccacggauag gaccacggga ugcgugg ccaggaugca ugucuugugg ccugg ；(4)SAT酶液为恒温扩增时必需的多酶组分体系，含T7 RNA聚合酶200 2000U/ 反应、M-MLV 反转录酶 40...
【专利技术属性】
技术研发人员：方亮，于明辉，居金良，
申请(专利权)人：上海仁度生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：31
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