细胞培养混合物的分离纯化方法技术

本发明专利技术公开了一种细胞培养混合物的分离纯化方法，包括使细胞培养混合物经过滤器进行过滤，该过滤器具有至少两层过滤膜，过滤膜的各层膜的公称孔径在滤液流动方向上逐级变小，而且第一层过滤膜的公称孔径约为2～10μm，最后一层过滤膜的公称孔径约为0.1～0.2μm。本发明专利技术的细胞培养混合物的分离纯化方法，具有针对性强，处理量大、分离纯化步骤简单、产品质量稳定、成本低等优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种生物制品的分离纯化的方法，特别涉及用以获得目的生物制品的。
技术介绍
目的生物制品的培养混合物的分离纯化是生物制品生产中最关键步骤之一，它是收获目的培养混合物与进一步下游加工之间的枢纽步骤，对生物制品的产量、质量、可重复性有着直接的影响，也决定了生物制品整体生产工艺的效率和成本耗费。现有生物制品生产工艺中常用的目的培养混合物分离纯化方法多为如离心、凝胶层析、过滤等几种方法的联合使用，多存在着许多问题，首先培养混合物在设备之间的转移容易造成产品的污染，其次，所使用的设备单批次处理量较少，不易进行生产规模扩大，再次，所用设备重复使用需进行反复清洗，增加了劳动力与生产成本的耗费。另外，现有工艺常常不能完全分离纯化目的培养混合物，造成最终的生物制品异源物质比较多。目前，人类、家禽、家畜的常规和非常规免疫是保障人类生命、健康的重要手段，所以各种病毒疫苗的需求量也在不断地增加。而大多数病毒疫苗都是通过细胞培养后分离纯化获得的，所以对于高效率、高品质地分离纯化细胞培养混合物的需求越来越受到人们的关注。
技术实现思路
使用现有的技术手段来分离纯化细胞培养混合物，由于存在上述问题，分离纯化过程复杂，不能大量、快速且高纯度地分离纯化细胞培养混合物，造成分离纯化的成本较高，生产时间长等缺陷，另外，最终的生物制品异源物质比较多，使用时副反应比较大。可见，现有的分离纯化方法已无法满足现实生产、生活的需要。因此，本专利技术特别针对细胞培养混合物的分离提纯进行了潜心研究，发现细胞培养混合物具有组分包含复杂、目的产物的含量普遍较低、起始用量较大、不同病毒颗粒大小具有一定差异等特点。对于细胞培养混合物这类生物制品，本专利技术人开创性地提出了对其进行分离纯化的新方法，克服了上述缺陷。本专利技术提供了一种，1. 一种，包括使细胞培养混合物经过滤器进行过滤，该过滤器具有至少两层孔径不同的过滤膜，过滤膜的各层膜的公称孔径在滤液流动方向上逐级变小，而且第一层过滤膜的公称孔径约为2 10 μ m，最后一层过滤膜的公称孔径约为0. 1 0. 2 μ m。2.根据技术方案1所述的，其中，细胞培养混合物选自动物用病毒细胞培养混合物、人用病毒细胞培养混合物或者分泌抗体的杂交瘤细胞培养混合物。3.根据技术方案1所述的，其中，所述过滤器具有三层、四层或五层过滤膜。4.根据技术方案1所述的，其中，在过滤过程中， 过滤膜前后的压差约为0. 05-0. IMPa05.根据技术方案1至4任一项所述的，其中，所述过滤器是过滤膜为折叠形式的过滤器。6.根据技术方案5所述的，其中，所述过滤器设置有壳体；折叠式的过滤膜将壳体内部分为中央区和边缘区。7.根据技术方案1至4任一项所述的，其中，所以细胞培养混合物选自口蹄疫病毒培养混合物，猪繁殖与呼吸综合征病毒培养混合物，猪瘟病毒培养混合物，猪肾细胞0 细胞)及猪睾丸细胞(ST细胞)；狂犬病毒培养混合物，乙型肝炎病毒培养混合物，流行性乙型脑炎病毒培养混合物，甲型肝炎病毒培养混合物或者脊髓灰质炎病毒培养混合物。8.根据技术方案1至4任一项所述的，其中，待过滤液的处理量为每0. OlMpa压差下每平方米过滤膜的流量范围约为100 200L。9.根据技术方案1所述的，其中，所述细胞培养混合物是口蹄疫病毒培养混合物，所述过滤膜是两层过滤膜，第一层过滤膜的公称孔径约为2 10 μ m，第二层过滤膜的公称孔径约为0. 1 0. 2 μ m。10.根据技术方案1所述的，其中，所述细胞培养混合物是猪繁殖与呼吸综合征病毒培养混合物，所述过滤膜是三层过滤膜，第一层过滤膜的公称孔径约为2 10 μ m，第二层过滤膜的公称孔径约为0. 2 2 μ m，第三层过滤膜的公称孔径约为0. 1 0. 2 μ m。本专利技术的一种，具有针对性强，处理量大、分离纯化步骤简单、产品质量稳定、成本低等优点，特别适合用于分离纯化口蹄疫病毒培养混合物或猪繁殖与呼吸综合征病毒培养混合物等，得到纯度较高的病毒疫苗混合物。另外，本专利技术中，可达到较大的单次处理量，高至几百升，从而易于扩大生产规模；并且，本专利技术对目的物分离纯化较为彻底，产物中的细胞碎片及其他较大物质均被截留，从而减少了生物制品的免疫接种副反应，减少了目的培养物的转移暴露，从而减少了目的物被污染的几率。本专利技术过程控制简易，使用过滤元件可以为一次性使用产品，无清洗、清洗验证等过程，节省劳动力和生产成本，提高生产效率；本专利技术过程控制简易，可以根据不同分离纯化目的物选择不同大小过滤元件及其组合，使用灵活，应用范围广泛。具体实施例方式本专利技术中的术语“动物”，指的是非人类的各种动物，特别优选的是畜类或禽类动物，比如猪、狗、牛、羊、鸡、鸭和/或鹅等。本专利技术中的术语“细胞培养混合物”，是指在现有的条件下培养病毒、抗体等所获得的细胞培养液混合物。具体地讲，所述细胞培养混合物，包括动物用病毒细胞培养混合物、人用病毒细胞培养混合物及分泌抗体的杂交瘤细胞培养混合物。其中所述细胞培养混合物中主要含有病毒颗粒(或抗体)，以及培养细胞、培养细胞碎片、蛋白质、核酸、多糖等杂质，如果所用的细胞培养基为含血清细胞培养基，则所得混合物中还含有残余血清。所得滤出液中要求具有较高含量的目的病毒，而所含杂质例如宿主蛋白、宿主核酸等尽量控制在较低水平，无菌类污染。病毒直径通常在20nm-200nm之间，而针对不同的病毒，采用不同的细胞进行培养，专利技术人仔细地研究了不同病毒及抗体的细胞培养混合物，所述动物用病毒细胞培养混合物具体如下口蹄疫病毒培养混合物，病毒直径约20-25nm，常用培养细胞为幼仓鼠肾传代细胞(BHK21细胞)；猪繁殖与呼吸综合征病毒培养混合物，病毒直径约50-60nm，常用培养细胞为Marcl45细胞；猪瘟病毒培养混合物，病毒直径约70nm，常用培养细胞为牛睾丸原代细胞(BT细胞)、猪肾细胞0 细胞)及猪睾丸细胞(ST细胞)；狂犬病毒培养混合物，病毒长约170-180nm，宽约75_80nm，常用的培养细胞为BHK21。所述人用病毒细胞培养混合物如下狂犬病毒培养混合物，病毒长约170-180nm， 宽约75-80nm，常用的培养细胞为非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)；乙型肝炎病毒培养混合物， 病毒直径约22nm，常用的培养细胞为中国仓鼠卵巢细胞(CH0细胞)；流行性乙型脑炎病毒培养混合物，病毒直径约40nm，常用的培养细胞为Vero细胞；甲型肝炎病毒培养混合物，病毒直径约27-32nm，常用的培养细胞为人二倍体细胞KMB17或2BS ；脊髓灰质炎病毒培养混合物，病毒直径约27-30nm，常用的培养细胞为人二倍体细胞2BS。由上述可知，大多数病毒的直径约为20-100nm，个别病毒的直径约在100-200nm 之间。对细胞培养混合物进行分离得到的目标混合物要求无污染物，并且杂质的含量应尽量控制到最低水平，其中所述污染物如细胞、细菌、霉菌和/或支原体等，所述杂质如杂蛋白、核酸和/或牛血清等，不同生物制品对此有不同的要求和限制。专利技术人发现各种污染物的直径与病毒的直径相比，均存在相当的差异，而在细胞培养混合物中，动物细胞的直径通常约为10-100 μ m，细菌细胞直径通常约为0. 5-2. 0 μ m， 真菌细胞直径通常约为10-40 μ m,支原本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种细胞培养混合物的分离纯化方法，包括使细胞培养混合物经过滤器进行过滤，该过滤器具有至少两层孔径不同的过滤膜，过滤膜的各层膜的公称孔径在滤液流动方向上逐级变小，而且第一层过滤膜的公称孔径为２～１０μｍ，最后一层过滤膜的公称孔径为０．１～０．２μｍ。

【技术特征摘要】
1.一种细胞培养混合物的分离纯化方法，包括使细胞培养混合物经过滤器进行过滤， 该过滤器具有至少两层孔径不同的过滤膜，过滤膜的各层膜的公称孔径在滤液流动方向上逐级变小，而且第一层过滤膜的公称孔径为2 10 μ m，最后一层过滤膜的公称孔径为 0. 1 0. 2 μ Hio2.根据权利要求1所述的细胞培养混合物的分离纯化方法，其中，细胞培养混合物选自动物用病毒细胞培养混合物、人用病毒细胞培养混合物或者分泌抗体的杂交瘤细胞培养混合物。3.根据权利要求1所述的细胞培养混合物的分离纯化方法，其中，所述过滤器具有三层、四层或五层过滤膜。4.根据权利要求1所述的细胞培养混合物的分离纯化方法，其中，在过滤过程中，过滤膜前后的压差为0. 05-0. IMPa05.根据权利要求1至4任一项所述的细胞培养混合物的分离纯化方法，其中，所述过滤器是过滤膜为折叠形式的过滤器。6.根据权利要求5所述的细胞培养混合物的分离纯化方法，其中，所述过滤器设置有壳体；折叠式的过滤膜将壳体内部分为中央区和边缘区。7.根据权利要求1至4任一项所述的细胞培养混合物的分离纯化...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈文庆，王建超，刘俊生，
申请(专利权)人：北京清大天一科技有限公司，
类型：发明
国别省市：11