本发明专利技术公开了重组人Rho激酶在制备药物中的应用。该重组人ROCK1片段蛋白(简称RP1)具有Rho激酶活性可以使相应底物磷酸化；RP1具有收缩血管作用，这种血管功能调节作用与血管内皮相关、被钙通道阻断剂所阻滞、被Rho激酶抑制剂-法舒地尔所抑制；以静脉注射方式进入动物体内后可以升高动物血压并表现出起效快的特点；以注射方式给予较高剂量时具有加快动物心率的作用；具有提高由于各种因素包括疾病因素降低的血管功能。RP1可应用于缓解、预防和/或治疗由各种因素包括疾病因素引起的血管功能降低相关的心脑血管疾病或症状的药物的制备。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及重组人Iih0激酶在制备药物中的应用。
技术介绍
众所周知，心脑血管系统疾病成为人类最为常见的一类疾病，占全球死亡率第一位，成为威胁人类健康和生命的最重要的疾病。随着我国经济的发展、人口老龄化的加速、 生活节奏的加快，人群中患高血压、高血脂、心力衰竭、脑卒中等心血管疾病明显增多，直接加重了家庭和社会负担。小分子GTP结合蛋白是一种在细胞功能调节过程中起关键作用的单体G蛋白分子。I^ho是一种小分子G蛋白，与GDP结合时处于失活状态，与GTP结合时转变为活性状态， 在介导血管壁细胞间的信号传导中起重要作用。1985年，从海兔属(Aplysia)动物体内发现Mio基因是Ras基因的一个同源性基因。基于其结构和功能分析，Rho超家族可分为Μιο、 Rac和Cdc42三个亚家族。钙离子很早就被证明是细胞骨架的一个关键调节因子，越来越多的证据表明，Rho超家族是另一个肌动蛋白依赖的调节细胞功能的重要因子。Rho 激酶(Rho-associated coiled-coil forming protein kinase, ROCK)有 2 个亚型，即ROCKl和R0CK2，它们都是丝氨酸/苏氨酸激酶。2个亚型的蛋白质一级结构有65% 的同源性，自N端依次含有激酶催化结构域、Iih0结合结构域、PH(pleckstrin homology)结构域和半胱氨酸富集结构域，其中催化结构域的同源性高达92%。R0CK1与R0CK2广泛分布于机体的大部分器官中，R0CK2在大脑中含量丰富，而R0CK1在非神经系统的器官表达量较高，如心脏、肺、骨胳肌。在细胞中，R0CK2主要位于胞浆中，只有少量位于细胞膜上。研究表明，Mio/ROCK介导的信号传导通路，对细胞的分裂、收缩、粘附、迁移、分泌等活动具有重要调节作用，如平滑肌细胞收缩、细胞骨架重构、细胞迁移和增殖及神经元的形成和轴突的生长等。迄今为止，我们没有查到重组人R0CK1功能片段蛋白在由各种因素包括疾病因素引起的血管功能降低相关的心脑血管疾病和/或症状的应用相关报道。
技术实现思路
本专利技术的一个实施方案提供了 SEQ ID NO :1所示的重组人R0CK1功能片段蛋白 (简称为RPl)在制备预防、缓解和/或治疗的心脑血管疾病和/或症状药物中的应用。所述的心脑血管疾病和/或症状可以是各种疾病因素引起的血管功能降低相关的。本专利技术的一个实施方案提供了 SEQ ID NO :1所示的重组人R0CK1功能片段蛋白在制备收缩血管药物中的应用。所述的血管收缩的作用与血管内皮相关、被钙通道阻断剂所阻滞、被MlO激酶抑制剂所抑制。所述的钙通道阻滞剂选自尼群地平、维拉帕米；所述的MlO 激酶抑制剂选自法舒地尔。本专利技术的一个实施方案提供了 SEQ ID NO :1所示的重组人R0CK1功能片段蛋白在制备升高血压的药物中的应用。所述的血压为收缩压和舒张压本专利技术的一个实施方案提供了 SEQ ID NO :1所示的重组人ROCKl功能片段蛋白在制备加快心率的药物中的应用。本专利技术的一个实施方案提供了 SEQ ID NO :1所示的重组人ROCKl功能片段蛋白在制备预防、缓解或治疗休克的药物中的应用。本专利技术的一个实施方案还提供了 SEQ ID NO :1所示的重组人ROCKl功能片段蛋白在抑制剂筛选和评价中的应用。在本专利技术中，所述预防、缓解和/或治疗由各种因素包括疾病因素引起的血管功能降低相关的心脑血管疾病和/或症状选自RPl具有Mio激酶活性可以使相应底物磷酸化；RPl具有收缩血管作用，这种血管功能调节作用与血管内皮相关、被钙通道阻断剂所阻滞、被Mio激酶抑制剂-法舒地尔所抑制；以静脉注射方式进入动物体内后可以升高动物血压并表现出起效快的特点；以注射方式给予较高剂量时具有加快动物心率的作用；具有提高由于各种因素包括疾病因素降低的血管功能的作用。本专利技术还提供了测定RPl活性的方法，RPl具有丝氨酸/苏氨酸激酶特性，使 S6(AKRRRLSSLRA)等多肽底物磷酸化而消耗ATP，通过测定ATP含量可检测RPl的激酶活性。因此本专利技术的RPl在可以在抑制剂筛选和评价中的应用，例如通过RPl酶活性评价进行药物筛选，评价化合物或其他物质对酶活性的影响。本专利技术是通过如下技术方案来实现通过克隆表达生物学技术获得RP1，利用 ROCKl蛋白活性评价系统，确证RPl的激酶生物学活性，通过体外血管环张力测定系统，进一步观察RPl对正常大鼠血管反应性的影响，判定RPl对大鼠离体血管的收缩作用及机制， 注射给与RPl观察对麻醉大鼠血压和心率的影响及判定在制备预防、缓解和/或治疗由各种因素包括疾病因素引起的血管功能降低相关的心脑血管疾病或症状的药物中的应用。附图说明图1.Rho激酶特异性抑制剂Y-27632对RPl活性的影响。图2.RPl对内皮完整和去内皮大鼠血管反应性的影响。图3.内皮源性活性物质对RPl缩血管作用的影响。图4.钙通道阻断剂对RPl缩血管作用的影响。图5.Rho激酶抑制剂-法舒地尔对RPl缩血管作用的影响图6.不同剂量的RPl对麻醉大鼠血压的升高值。图7.RPl升高麻醉大鼠血压的作用。图8.不同剂量的RPl对麻醉大鼠心率的影响。具体实施例方式下面结合本专利技术，进一步说明RPl在体内升高血压的药理作用及在治疗由各种因素包括疾病因素引起的血管功能降低相关的心脑血管疾病的应用。下述实施例更详细地举例说明本专利技术，并不是对本专利技术的任何限制。下面结合附图和实施例对本申请专利进一步说明。实施例1 :RP1的激酶生物学活性评价。本实施例用Kinase-Glo Luminescent Kinase Assay 方法鉴定了 RPl 的活性。反应在白色不透明的96孔板中进行，加入5 μ L激酶缓冲液(25mmol · Γ1 Tris-HCl, ρΗ7· 5， IOmmol · L-1MgCl2,0· Img · mL_1BSA)，10 μ L 激酶，10 μ L S6 (AKRRRLSSLRA)多肽底物及 5 μ L ATP。混合后37°C孵育一定时间，加入50 μ L Kinase-Glo试剂，室温lOmin，在SpectraMax M5上读各孔的相对发光值。反应时加入10 μ mol · L—1的Y-27632 (Rho激酶的特异性抑制剂)，观察其能否选择性地抑制RPl的活性，同时与不加激酶的空白对照和加入激酶的阳性对照比较，以判定实施例1中RPl的Mio激酶生物学活性。加入激酶的阳性对照与不加激酶的空白对照比较，有显著性差异，提示RPl具有生物学活性。加入激酶的阳性对照与加入Mio激酶选择性抑制剂-Y-27632的对照孔比较， 具有显著性差异，证明Y-27632能特异性抑制RPl的Mio激酶活性，结果见附图1。实施例2 =RPl对麻醉大鼠血管反应性的影响。本实施例中的实验动物选用雄性SD大鼠(体重250 300g)。大鼠断头处死后，迅速取出胸主动脉，剪成2 3mm长的血管环，将血管环置于盛有K-H液IOmL (37°C恒温，并持续通入95%氧气和5%二氧化碳的混合气体)的浴槽中，张力变化被传输并记录在BL-420S 生物机能实验系统中。血管环在1.2g张力稳定60min，期间每20min换K-H液1次。以 6本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１所示的重组人ＲＯＣＫ１功能片段蛋白在制备预防、缓解和／或治疗的心脑血管疾病和／或症状药物中的应用。
【技术特征摘要】
1.SEQ ID NO :1所示的重组人ROCKl功能片段蛋白在制备预防、缓解和/或治疗的心脑血管疾病和/或症状药物中的应用。2.根据权利要求1的应用，其特征在于，所述的心脑血管疾病和/或症状是由血管功能降低相关的。3.SEQ ID NO :1所示的重组人ROCKl功能片段蛋白在制备收缩血管药物中的应用。4.根据权利要求3的应用，其特征在于，所述的血管收缩的作用与血管内皮相关、可被钙通道阻断剂所阻滞、可被Mio激酶抑制剂所抑制。5.根据权利要求4的应用，其特征在于，所述的钙通道阻滞剂选自尼...
【专利技术属性】
技术研发人员：方莲花，杜冠华，宫丽丽，陈柏年，
申请(专利权)人：中国医学科学院药物研究所，
类型：发明
国别省市：11
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