一种基于磁分离与高保真聚合酶校正功能的核酸序列分析方法，1)将耐核酸外切酶消化的测序引物固定于磁性介质上，与待测DNA序列进行杂交；2)加入成分包括不具有核酸外切酶活性之DNA聚合酶的延伸反应溶液，延伸经过标记的脱氧核糖核苷酸单体与双脱氧核糖核苷酸单体，通过检测标记物信号得到核苷酸种类与个数信息；3)加入成分包括具有核酸外切酶活性之高保真DNA聚合酶的延伸反应溶液，利用高保真聚合酶的校正功能移除2)中已延伸的ddNTP并替换延伸上耐核酸外切酶消化的核苷酸单体；4)对磁性介质进行磁分离并清洗；循环上述步骤2)、3)和4)所进行的过程，直到确定待测DNA中的核苷酸序列信息。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及核酸序列分析领域，特别是涉及一种，所述核酸序列比由常规Sanger测序法所能分析的序列长度更长。
技术介绍
生物的遗传信息由非常长的脱氧核糖核酸(DNA)分子组织成染色体的形式储存。 在生物学研究中，DNA序列分析对于遗传信息的获取至关重要，是遗传学和基因组学发展的基础。基于测序技术的深入而全面的遗传学和基因组学研究可以应用于基础研究(基因功能鉴定、信号通路构建、系统生物学、生物进化、疾病机理研究等)，也可以应用于临床领域 (疾病预测、预防、早期诊断、个性化治疗等)。2000年6月沈日，人类基因组工作草图由美国、英国、法国、德国、日本和中国科学家宣布基本完成，2002年2月又公布了“精细图”。这是基因组学研究领域的一个里程碑式的工作。随着人类基因组计划的实施，也推动了模式生物基因组的测序工作。目前，科学家已完成了水稻、家蚕、大鼠、小鼠、熊猫等多类物种的基因组测序。自人类基因组测序完成，美国国立卫生研究院(National Institute of Health, NIH)便提供了 “革命性基因组测序技术”(Revolutionary Genome Sequencing Technologies)项目基金，以开发革命性的DNA测序技术为目标，并随之推出了 1000美元基因组计划，使得发展高通量、低成本、长读取长度的测序技术越来越受到关注，也预示着将来的测序技术不仅只作为一种科学研究的工具，而将发展成为一种产业，为人类的生活健康服务。针对基因组测序，已发展了多种方法，最早可以追溯到20世纪50年代。1%4年已经出现了关于测序技术的报导，即Whitfeld等用化学降解的方法测定多聚核糖核苷酸序列。1975年至1977年间，Sanger等专利技术的双脱氧核苷酸(Dideoxyribonucleotide triphosphate, ddNTP)末端终止法和Gilbert等专利技术的化学降解法，标志着第一代测序技术的诞生，它帮助人们完成了从噬菌体基因组到人类基因组草图等大量的测序工作，但由于其存在成本高、速度慢等方面的不足，因此并不是最理想的测序方法。在此后三十几年的发展中陆续产生了第二代测序技术，包括Roche公司的妨4技术、Illumina公司的Solexa 技术和ABI公司的SOLiD技术。与第一代技术相比，第二代测序技术不仅保持了高准确度， 而且大大降低了测序成本并极大地提高了测序速度，但由于第二代测序技术产生的测序结果长度较短，比较适合对序列已知的基因组进行重新测序，在对全新的基因组进行测序时还需要结合第一代测序技术。近年，Helicos公司的单分子测序技术、Pacific Biosciences 公司的单分子实时(Single Molecule Real Time, SMRT)测序技术和 Oxford NanoporeTechnologies公司正在研究的纳米孔单分子测序技术被认为是第三代测序技术。第一代测序方法中，Sanger法和Gilbert法都是先得到随机长度的DNA链，再通过电泳方法读出序列。两者不同之处在于，Sanger法通过ddNTP随机中断待测序列的合成，而Gilbert法是先用特定的化学试剂标记碱基再用化学方法打断待测序列。目前广泛使用的测序方法都基于Sanger法，该方法的原理是利用DNA聚合酶对结合在待测定序列模板上的引物进行延伸，直到掺入一种ddNTP为止。每一轮序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有四种脱氧核糖核苷酸(Deoxyribonucleotide triphosphate, dNTP), 并混有一定比例的一种ddNTP，DNA核苷酸链通过和dNTP戊糖C-3位的羟基反应而延长， 而ddNTP由于其戊糖C-3位不含羟基而使核苷酸链的延伸反应终止，由此产生不同长度的核酸片段，它们具有共同的起始点，但终止在不同的ddNTP上，进而通过各种信号分析手段读取核苷酸序列，包括最初的电泳方法以及后来发展的荧光标记方法等。然而，除去成本与通量的考虑，目前基于Sanger法的测序方法都存在读长不够长(500-1000bp)的主要缺陷。 造成此缺陷的原因主要有两方面一方面由于聚合酶的合成能力有限，合成的片段长度有限(500-700bp);另一方面由于目前信号分析能力有限，超过一定长度后，由于信号累积造成的背景干扰或信号淬灭致无法获取等原因，无法解码长度更长的序列。读长不够长之缺陷即引起了核酸片段拼接组装的难题，尤其是存在大量重复序列的情况下。因此，在片段合成和信号解析方面取得突破是改进Sanger测序法读长不够长之缺陷的关键。众所周知，高保真DNA聚合酶由于具有3’ -5’核酸外切酶活性，能够在DNA核苷酸链延伸的过程中，将错误配对的核苷酸移除，再以正确配对的核苷酸为底物继续进行DNA 核苷酸链的合成，称之为高保真聚合酶的校正功能。在测序技术的发展过程中，为了提高 DNA聚合酶的合成能力，通过基因工程的方法对聚合酶进行了改造，得到了专为测序反应使用的不具有3’ -5’核酸外切酶活性且合成速度较快的DNA聚合酶，称之为测序酶。测序酶由于在延伸DNA核苷酸链的过程中未对掺入的核苷酸进行检验与校正，在提高DNA核苷酸链合成速率的同时，也一定程度上提高了合成出错的概率。而实际上，高保真聚合酶的校正功能除了能将错配的核苷酸移除，还能将中断DNA核苷酸链合成的核苷酸移除，掺入正确配对并能继续DNA核苷酸链合成的核苷酸，使DNA核苷酸链的延伸合成得以继续。因此，高保真DNA聚合酶的校正功能，不仅能提高DNA核苷酸链合成的正确率，也能够降低测序过程中的背景信号，是具有双重功能的非常有用而方便的工具酶。
技术实现思路
专利技术目的本专利技术的目的在于解决上述所提到的传统Sanger测序方法中读长不够长的问题，提出一种，具有背景信号低、读长更长和操作方便的优点。技术方案一种，1) 将耐3’ -5’核酸外切酶消化的测序引物固定于磁性介质上，与待测DNA序列进行杂交；2) 加入成分包括不具有3’ -5’核酸外切酶活性之DNA聚合酶的第一步延伸反应溶液，延伸经过标记的脱氧核糖核苷酸单体与双脱氧核糖核苷酸单体，通过检测标记物信号得到核苷酸种类与个数信息；3)加入成分包括具有3’ -5’核酸外切酶活性之高保真DNA聚合酶的第二步延伸反应溶液，利用高保真聚合酶的校正功能移除2)中已延伸的ddNTP并替换延伸上耐3’ -5’核酸外切酶消化的核苷酸单体；4)对磁性介质进行磁分离并清洗；循环上述步骤 2)、3)和4)所进行的过程，直到确定待测DNA中的核苷酸序列信息。所述磁性介质为体现磁学性质的物体，包括具有磁学性质的物质构成的物体或以具有磁学性质的物质为部件的物体，包括平板、微孔、微球。所述经过标记的脱氧核糖核苷酸单体与双脱氧核糖核苷酸单体为直接或间接标记着荧光分子、放射性同位素或酶的dNTP与ddNTP。所述经过标记的dNTP与ddNTP，所述四种单体均标记相同的标记物，或标记不相同、不完全相同的标记物。经过标记的dNTP与ddNTP，其中ddNTP与同种类dNTP之间的分子数比例为1:50^1:10000ο所述不具有3，-5，核酸外切酶活性之DNA聚合酶为Taq DNA聚合酶、Τ7测序酶、 Vent D本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种基于磁分离与高保真聚合酶校正功能的核酸序列分析方法，其特征在于：１） 将耐３’－５’核酸外切酶消化的测序引物固定于磁性介质上，与待测ＤＮＡ序列进行杂交；２） 加入成分包括不具有３’－５’核酸外切酶活性之ＤＮＡ聚合酶的第一步延伸反应溶液，延伸经过标记的脱氧核糖核苷酸单体与双脱氧核糖核苷酸单体，通过检测标记物信号得到核苷酸种类与个数信息；３） 加入成分包括具有３’－５’核酸外切酶活性之高保真ＤＮＡ聚合酶的第二步延伸反应溶液，利用高保真聚合酶的校正功能移除２）中已延伸的ｄｄＮＴＰ并替换延伸上耐３’－５’核酸外切酶消化的核苷酸单体；４） 对磁性介质进行磁分离并清洗；循环上述步骤２）、３）和４）所进行的过程，直到确定待测ＤＮＡ中的核苷酸序列信息。
【技术特征摘要】
1.一种基于磁分离与高保真聚合酶校正功能的核酸序列分析方法，其特征在于1) 将耐3’ -5’核酸外切酶消化的测序引物固定于磁性介质上，与待测DNA序列进行杂交；2) 加入成分包括不具有3’ -5’核酸外切酶活性之DNA聚合酶的第一步延伸反应溶液，延伸经过标记的脱氧核糖核苷酸单体与双脱氧核糖核苷酸单体，通过检测标记物信号得到核苷酸种类与个数信息；3)加入成分包括具有3’ -5’核酸外切酶活性之高保真DNA聚合酶的第二步延伸反应溶液，利用高保真聚合酶的校正功能移除2)中已延伸的ddNTP并替换延伸上耐3’ -5’核酸外切酶消化的核苷酸单体；4)对磁性介质进行磁分离并清洗；循环上述步骤 2),3)和4)所进行的过程，直到确定待测DNA中的核苷酸序列信息。2.根据权利要求1所述基于磁分离与高保真聚合酶校正功能的核酸序列分析方法，其特征在于所述磁性介质为体现磁学性质的物体。3.根据权利要求1所述基于磁分离与高保真聚合酶校正功能的核酸序列分析方法，其特征在于所述经过标记的脱氧核糖核苷酸单体与双脱氧核糖核苷酸单体为直接或间接标记着荧光分子、放射性同位素或酶的dNTP与ddNTP。4.根据权利要求2所述基于磁分离与高保真聚合酶校正功能的核酸序列分析方法，其特征在于所述体现磁学性质的物体为具有磁学性质的物质构成的物体或以具有磁学性质的物质为部件的物体。5.根据权利要求3所述基于磁分...
【专利技术属性】
技术研发人员：何农跃，曾新，
申请(专利权)人：东南大学，
类型：发明
国别省市：84
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