本发明专利技术涉及一种耐高温中性木聚糖酶基因及含有该基因的工程菌，基因序列见序列1，基因全长为1134bp，命名为XynG1-1，其编码377个氨基酸，其分子量为41267Da，其中前39个氨基酸为其信号肽，第49～235个氨基酸为糖苷水解酶GH11家族的保守序列，第263～377个氨基酸为碳水化合物结合组件CBM6家族的保守序列。本发明专利技术提供的工程菌发酵得到的重组酶的最适作用温度和最适作用pH分别为60℃和7.0，在pH7.0、70℃保温1h，相对酶活在65％以上，在pH9、温度60℃条件下保温1h，相对酶活在60％以上。本发明专利技术的木聚糖酶在高温下有良好的稳定性，适合造纸、食品和饲料等多个工业领域的应用，具有广阔的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程领域，尤其涉及一种耐高温中性木聚糖酶基因及含有该基因的工程菌。
技术介绍
木聚糖酶(1，4_β-D-xylanase ;EC3. 2. 1.8)是一种重要的工业用酶，在造纸工业、食品、能源、饲料以及环境等领域中显示了广阔的应用前景，特别是在纸浆生物漂白中的巨大应用潜力早已引起各界的高度关注。木聚糖酶处理各种浆料的作用是降解浆中的木聚糖，使浆中半纤维素的含量降低，并使纤维素细胞壁结构变得松弛，同时使与浆中残余木素连接的半纤维素降解，形成脱木素或有利于脱木素的状态。通过木聚糖酶的预处理，不仅可以提高纸浆的白度，降低打浆的能耗，改善浆料的强度性能，而且，可以减少后继工序漂剂的用量，降低废液的毒性，减轻环境污染。目前，以无元素氯和全无氯漂白工艺为代表的纸浆绿色清洁漂白已经成为世界各国造纸业纸浆漂白发展的必然趋势，木聚糖酶酶法助漂新工艺已在欧洲和北美的30余家大型纸厂得到应用，成为生物技术在造纸工业应用最成功的一例。其中，加拿大已有约10 % 的硫酸盐法纸浆厂采用了该项新工艺。丹麦诺维信公司和美国山道斯化学公司等多家酶制剂厂商，纷纷推出了专门用于纸浆处理的木聚糖酶和纤维素酶新产品，但到目前为止，工业上用于纸浆漂白的木聚糖酶大多是中性偏酸的，最适反应温度大多在50°C左右，众所周知， 纸浆蒸煮和漂白基本都是在高温和强碱的条件下进行的，使得现有的低温酸性木聚糖酶产品在此领域的应用受到了极大的限制，另外，在饲料和食品领域，木聚糖酶应用在饲料的造粒和食品的焙烤工序中，仍然要求所用的木聚糖酶在高温条件下能够保持较高的酶活，因此，研究开发耐高温的木聚糖酶产品将会带来良好的经济效益和社会效益。国外对木聚糖酶的研究已达到了分子水平，自上世纪七十年代末开展木聚糖酶基因的研究工作以来，已有150多种来自真菌和细菌的木聚糖酶基因被克隆并在大肠杆菌中表达° 其中，Ossi Turunen 等人使用 Swiss-pdbviewer 对来源于 Trichoderma ressei 的 GHll家族木聚糖酶XYNII的结构进行分析；并用PCR的方法在XYNII中引入5个Arg点突变时，突变酶在65°C的半衰期提高4-5倍，最适pH也有所提高；Miyazaki K等人对来源于 Bacillus subtilis的木聚糖酶基因运用DNA shuffling技术进行研究，获得了一株最适反应温度提高了 10°C，60°C时热稳定性提高了 M倍的突变酶；2009年，Ismail Akyol等克隆到Neocallimastix sp. GMLF2的木聚糖酶基因xyn2A，并在大肠杆菌中得到表达，其最适作用温度和PH分别为50°C和6. 5。我国在木聚糖酶方面的研究起步较晚，但发展迅速。上世纪八十年代初期，中国科学院微生物所在张树政院士的带领下，开始了我国对木聚糖酶的早期研究工作，首次从海枣曲酶(Aspergillus phoe-nicis)中纯化得到了四种木聚糖酶酶I、酶II、酶III和酶IV，并深入研究了活力较高的组分酶III的酶学性质。“九五”期间，山东大学微生物技术国家重点实验室曲音波教授等开展了木聚糖酶在造纸方面的应用研究，从碱性假单胞菌sp. G6-2分离出两种木聚糖酶XynA和XynB。目前，我国对木聚糖酶的研究大多停留在产酶菌株的筛选、酶的纯化和酶学性质研究方面，部分课题已涉及木聚糖酶的分子生物学研究、 木聚糖酶基因克隆、表达和重组。Chen等用易错PCR技术对来源于真菌Neocallimastix patriciarum的木聚糖酶进行定向进化研究，获得了比野生型蛋白质耐碱性更强的木聚糖酶。09年Yingguo Bai等从云南温泉中分离到产木聚糖酶的菌株thermoacidophilic Alicyclobacillus sp. A4，克隆得到木聚糖酶基因XynA4，并在大肠杆菌中表达。测得该木聚糖酶XynA4的最适作用pH和最适作用温度分别为7.0和55°C。Jing Wang等在造纸厂污水中分离到产碱性木聚糖酶的Baci llus pumilus BYG野生型菌株，该木聚糖酶的最适作用 PH为8. 0-9. 0，最适作用温度50°C，并克隆到木聚糖酶基因XynBYG，该基因长度为687bp， 编码2 个氨基酸，成功应用定点突变技术将该酶的最适作用温度提高了 5°C。据统计， 目前国内木聚糖酶的研究中，木聚糖酶的最适作用温度最高为85°C，而其最适作用pH为 6. 5，来自于2009年新疆大学的Wei Zhang等将嗜热网团菌(Dictyoglomus thermophilum Rt46B. 1)的木聚糖酶基因xynB在Bacillus subtilis中表达后获得的木聚糖酶。综上可见，国内外各研究机构正致力于获得不同来源的具有一定优良性质的木聚糖酶基因，并且构建合适的工程菌株，使其更适合工业应用的极端条件，开拓其更广的应用前景。
技术实现思路
本专利技术的目的在于通过产木聚糖酶菌种的筛选，从而获得编码耐高温中性木聚糖酶的基因，并且进一步构建能高效表达此耐高温中性木聚糖酶的基因工程菌。本专利技术实现目的的技术方案如下一种耐高温中性木聚糖酶基因，基因序列见序列1。而且，具体方法如下根据已报道木聚糖酶基因，分析其保守序列，设计本专利技术的耐高温中性木聚糖酶基因的扩增引物如下上游引物为序列2，下游引物为序列3，扩增模板为坎皮纳斯类芽孢杆菌基因组DNA，其扩增的反应条件为95°C 5min ； 94°C 45S，55°C 45S，72°C 90S, 30 个循环；72°C延长 IOmin ；扩增体系50 μ L :ddH20 35. 5 μ L, IOXbuffer 5 μ L, dNTPs 2. 5mmol/L 每个 5 μ L,上游引物ΙΟμ θΙ/L 1. 5μ L，下游引物 ΙΟμ θΙ/L 1. 5 μ L，DNA 模板 1 μ L，TaqDNA 聚合酶0.5yL;PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，得到1134bp的单一条带，回收PCR产物，得到耐高温中性木聚糖酶全基因；一种序列1的耐高温中性木聚糖酶基因的基因工程菌。而且，宿主菌为大肠杆菌E. coli BL21。而且，构建方法如下(1)重组质粒ρΕΤ-XynGl-l的构建与鉴定将XynGl-I基因的PCR纯化产物与载体pET_22b (+)经Hind III和XhoI双酶切后，分别用小量DNA回收试剂盒回收酶切产物，应用DNA连接试剂盒的Solution I在16°C 的条件下连接12h，将目的基因XynGl-I定向连接至载体pET_22b (+)，将连接产物应用化学转化法转化到E. coli DH5a感受态细胞中，在含有Amp的LA培养基中筛选培养，挑取阳性转化子，培养后提质粒，用Hind III和B10I双位点单、双酶切鉴定，测序；(2)大肠杆菌E. coli BL21基因工程菌的构建将测序正确的重组质粒ρΕΤ-XynGl-l应用化学转化的方法转化到E. coli BL21感受态细胞中，挑取阳性转化子，进行IPTG诱导表达。本专利技术的优点和积极效果如下本专利技术提供了一种来源于坎皮纳斯类芽孢杆菌(TCCC11578)的耐高温中性木聚糖酶基因以及带有该基因序列的E.本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种耐高温中性木聚糖酶基因，其特征在于：基因序列见序列１。
【技术特征摘要】
1.一种耐高温中性木聚糖酶基因，其特征在于基因序列见序列1。2.根据权利要求1所述的耐高温中性木聚糖酶基因，其特征在于所述耐高温中性木聚糖酶基因全长为1134bp，命名为XynGl-Ι，其编码377个氨基酸，其分子量为4U67Da，其中前39个氨基酸为其信号肽，第49 235个氨基酸为糖苷水解酶GHll家族的保守序列， 第263 377个氨基酸为碳水化合物结合组件CBM6家族的保守序列。3.根据权利要求1所述的耐高温中性木聚糖酶基因，其特征在于所述基因来源于坎皮纳斯类芽孢杆菌。4.一种携带权利要求1中所述的耐高温中性木聚糖酶基因的菌株。5.根据权利要求4所述的携带耐高温中性木聚糖酶基因的菌株，其特征在于宿主菌为大肠杆菌E. coli BL21。6.根据权利要求4或5所述的携带耐高温中性木聚糖酶基因的菌株，其特征在于构建方法如下(1)根据已报道木聚糖酶基因，分析其保守序列，设计本发明的耐高温中性木聚糖酶基因的扩增引物如下上游引物为序列2，下游引物为序列3 ；扩增模板为坎皮纳斯类芽孢杆菌基因组DNA，其...
【专利技术属性】
技术研发人员：路福平，刘逸寒，郑宏臣，王春霞，王建玲，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：12
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