一种鸭源常见细菌多重PCR检测试剂盒及其检测方法技术

本发明专利技术属于生物检测技术领域，具体涉及一种鸭源常见细菌多重PCR检测试剂盒及其检测方法。本发明专利技术公开了一种鸭源常见细菌多重PCR检测试剂盒，其包含3对引物：RADnaBP1和RADnaBP2；E.coliphoAP1和E.coliphoAP2；SalminvAP1和SalminvAP2，其中所述RADnaBP1的核酸序列如SEQIDNO.1所示，所述RADnaBP2的核酸序列如SEQIDNO.2所示，所述E.coliphoAP1的核酸序列如SEQIDNO.3所示，所述E.coliphoAP2的核酸序列如SEQIDNO.4所示，所述SalminvAP1的核酸序列如SEQIDNO.5所示，所述SalminvAP2的核酸序列如SEQIDNO.6所示。本发明专利技术能快速、方便、特异、灵敏地检测鸭疫里默氏杆菌、大肠杆菌和沙门氏菌，易于大范围推广，可用于细菌鉴定、疾病诊断和流行病学调查，具有广阔的市场前景和较大的经济效益。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物检测
，具体涉及一种鸭源常见细菌多重PCR检测试剂盒及其检测方法。
技术介绍
鸭疫里默氏杆菌病、大肠杆菌病和沙门氏菌病是当前危害养鸭业最为严重的三种细菌性传染病。鸭疫里默氏菌(Riemerella anatipestifer，RA)病是一种主要侵害鸭、火鸡和其他鸟类的接触性传染病。迄今为止，已确认的RA血清型有21个(1 21型)。该病主要病理变化是纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎、脑膜炎、干酪样输卵管炎等，发病率高，病死率高(死亡率1% - 80%,甚至高达90%以上)，耐过鸭多成僵鸭，生长迟缓，造成极大的经济损失。鸭大肠杆菌病是由致病性大肠杆菌感染所引起，由于感染鸭的年龄、抵抗力以及大肠杆菌的致病力、感染途径的不同，可以产生许多症状和病变不同的病型。在雏鸭引起大肠杆菌肝炎和脑炎为特征，在产蛋鸭以发生大肠杆菌性生殖器官病变为特性。感染雏鸭的大肠杆菌主要有078、08、07、073、019、045等。大肠杆菌也是一种条件性致病菌，当由于各种应激刺激造成鸭体的免疫功能降低时，就会发生感染，因此，在临诊上常常成为鸭疫里默氏杆菌病的并发菌。鸭沙门氏菌病是由鼠伤寒沙门氏菌、鸭沙门氏菌和肠炎沙门氏菌等引起的疾病的总称。各种日龄的鸭都能感染，主要发生于雏鸭，可造成大批死亡。这一类细菌常引起人的食物中毒，在公共卫生上有重要意义。以上3种细菌性传染病都易发生于雏鸭，且其临床症状和剖检病变相似，难以区分。目前实验室的诊断方法主要靠细菌的分离鉴定与鉴定，以及针对单个病原建立的PCR 检测方法等。细菌的分离与鉴定是诊断的金标准，但这种方法所需检测时间长、造作繁琐， 且不能批量检测。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种快速、特异性和灵敏性高的鸭源常见细菌多重PCR检测试剂盒及其检测方法。为此，本专利技术公开了一种鸭源常见细菌多重PCR检测试剂盒，其包含3对引物RA DnaB Pl 和 RA DnaB P2 ；E.coli phoA Pl和 E. coli phoA P2 ；Salm invA Pl和 Salm invA P2，其中所述RA DnaB Pl的核酸序列如SEQ ID NO. 1所示，所述RA DnaB P2的核酸序列如 SEQ ID N0. 2所示，所述E. coli phoA Pl的核酸序列如SEQ ID N0. 3所示，所述E. coli phoA P2的核酸序列如SEQ ID N0. 4所示，所述Salm invA Pl的核酸序列如SEQ ID N0. 5 所示，所述Salm invA P2的核酸序列如SEQ ID N0. 6所示。所述细菌为鸭疫里默氏杆菌和/或大肠杆菌和/或沙门氏菌。本专利技术利用申请人测定并提交到GenBank上鸭疫里默氏杆菌不同血清型DnaB基因的序列(GenBank accession numbers JF723296 to JF723300)，与在 GenBank 上发表的其他细菌如大肠杆菌、沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌等的DnaB基因进行比对，选择序列差异大的区域设计引物。本专利技术将选择大肠杆菌的持家基因PhoA基因作为靶基因，用于鸭大肠杆菌的检测。对已发表的不同细菌的DnaB基因序列作序列比对，设计引物。选择phoA作为靶基因主要基于如下两点考虑肝、脑组织中的大肠杆菌是直接感染或继发感染后才进入这些组织的，并与疾病相关，即使检测时有少量污染进来的大肠杆菌，也是低于多重PCR的检测线； 另外，大肠杆菌携带的毒力因子可因不同的菌株有所变化，且有报道表明，致病性大肠杆菌中检测到的那些毒力因子，在非致病性的大肠杆菌中也可检测到。本专利技术将选择目前科研人员公认可行的沙门氏菌侵袭蛋白基因irwA作为检测的靶基因，并根据已发表的沙门氏菌irwA基因序列重新设计引物。在一些实施例中，所述检测试剂盒还含有甘油、IOX反应缓冲液、DNA聚合酶、 dNTP (2. 5mM each)。另一方面，本专利技术还公开了一种鸭疫里默氏杆菌和/或大肠杆菌和/或沙门氏菌的检测方法，包括下列步骤取禽类(如鸭)组织样本或分离细菌的DNA并以此为模板；利用 3 对引物RA DnaB Pl 和 RA DnaB P2 ； E. coli phoA Pl 和 E. coli phoA P2 ； Salm invA Pl和Salm invA P2，进行多重PCR,其中所述RA DnaB Pl的核酸序列如SEQ ID NO. 1所示，所述RA DnaB P2的核酸序列如SEQ ID N0. 2所示，所述E. coli phoA Pl的核酸序列如SEQ ID N0. 3所示，所述E. coli phoA P2的核酸序列如SEQ ID N0. 4所示， 所述Salm invA Pl的核酸序列如SEQ ID N0. 5所示，所述Salm invA P2的核酸序列如 SEQ ID N0. 6所示；进行多重PCR反应；琼脂糖凝胶电泳，在紫外成像仪下观察，若出现459bp，720bp和256bp条带，则表明鸭组织样本中含鸭疫里默氏杆菌和大肠杆菌和沙门氏菌；若出现459bp和720bp条带，则表明鸭组织样本中含鸭疫里默氏杆菌和大肠杆菌；若459bp和256bp条带，则表明鸭组织样本中含鸭疫里默氏杆菌和沙门氏菌；若出现720bp和256bp条带，则表明鸭组织样本中含大肠杆菌和沙门氏菌；若只出现459bp条带，则表明鸭组织样本中含或分离的细菌是鸭疫里默氏杆菌；若只出现720bp条带，则表明鸭组织样本中含或分离的细菌是大肠杆菌；若只出现256bp条带，则表明鸭组织样本中含或分离的细菌是沙门氏菌。在一些实施例中，所述禽类为鸭、鹅、火鸡、鸡或鸟类中任何之一。在一些实施例中，所述琼脂糖凝胶电泳法具体可为1-2% (质量百分含量)琼脂糖凝胶电泳。所述多重PCR的反应条件具体可为94°C预变性5分钟，再94°C 45秒，57 — 60 0C 40秒，72°C 60秒共运行30个循环，最后72°C延伸10分钟。所述多重PCR的反应体系中，反应初始时，每个所述引物对的上游引物和下游引物的终浓度可为5-40 pmol;,其中最优化RA DnaB Pl和RA DnaB P2的终浓度为5 pmol ； E. coli phoA Pl 和 E. coli phoA P2 的终浓度为 20 pmol ；Salm invA Pl 和 Salm invA P2 的终浓度为5 pmol。与现有技术相比，本专利技术具有如下的优点1)在一个反应体系中可同时检测鸭疫里默氏杆菌、大肠杆菌和沙门氏菌这3种病原菌。 2)在普通的生物学实验室有PCR仪就可完成检测工作，检测时间可以缩短到3 5个小时，大大缩短了检测时间。3)能批量对样品进行检测，可用于实验室细菌的鉴定和临床样品的检测与诊断。本专利技术的建立的多重PCR检测方法具有可同时检测鸭最常见的3种传染病的病原，且快速、特异和操作简单的特点，填补了目前缺少快速鉴别这3种病原方法的空白，易于大范围推广应用，可检测这3种鸭病的流行，具有广阔的市场前景和较大的经济效益。附图说明图1.本专利技术一鸭源常见细菌多重PCR检测试剂盒引物浓度范围实验结果； 图2.本专利技术一鸭源常见细菌多重PCR检测试剂盒的特异性试验结果；图3.本专利技术本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种鸭源常见细菌多重ＰＣＲ检测试剂盒，其特征在于其包含３对引物：ＲＡ　ＤｎａＢ　Ｐ１和ＲＡ　ＤｎａＢ　Ｐ２；Ｅ．ｃｏｌｉ　ｐｈｏＡ　Ｐ１和Ｅ．ｃｏｌｉ　ｐｈｏＡ　Ｐ２；Ｓａｌｍ　ｉｎｖＡ　Ｐ１和Ｓａｌｍ　ｉｎｖＡ　Ｐ２，其中所述ＲＡ　ＤｎａＢ　Ｐ１的核酸序列如ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．１所示，　所述ＲＡ　ＤｎａＢ　Ｐ２的核酸序列如ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．２所示，　所述Ｅ．ｃｏｌｉ　ｐｈｏＡ　Ｐ１的核酸序列如ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．３所示，　所述Ｅ．ｃｏｌｉ　ｐｈｏＡ　Ｐ２的核酸序列如ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．４所示，　所述Ｓａｌｍ　ｉｎｖＡ　Ｐ１的核酸序列如ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．５所示，　所述Ｓａｌｍ　ｉｎｖＡ　Ｐ２的核酸序列如ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．６所示。

【技术特征摘要】
1.一种鸭源常见细菌多重PCR检测试剂盒，其特征在于其包含3对引物RA DnaB Pl 和 RA DnaB P2 ；E. coli phoA Pl 和 E.coli phoA P2 ；Salm invA Pl 禾口 Salm invA P2，其中所述RA DnaB Pl的核酸序列如SEQ ID NO. 1所示，所述RA DnaB P2的核酸序列如SEQ ID NO. 2所示，所述E.coli phoA Pl的核酸序列如SEQ ID NO. 3所示，所述E. coli phoA P2 的核酸序列如SEQ ID NO. 4所示，所述Salm invA Pl的核酸序列如SEQ ID NO. 5所示， 所述Salm invA P2的核酸序列如SEQ ID NO. 6所示。2.根据权利要求1所述的鸭源常见细菌多重PCR检测试剂盒，其特征在于所述细菌为鸭疫里默氏杆菌和/或大肠杆菌和/或沙门氏菌。3.根据权利要求2所述的鸭源常见细菌多重PCR检测试剂盒，其特征在于其还含有 10 X反应缓冲液、DNA聚合酶、dNTP和甘油。4.一种鸭源常见细菌多重PCR的检测方法，包括下列步骤取禽类组织样本或分离细菌样品的DNA并以此为模板；利用 3 对引物RA DnaB Pl 和 RA DnaB P2 ；E. coli phoA Pl 和 E. coli phoA P2 ；Salm invA Pl禾Π Salm invA P2，进行多重PCR,其中所述RA DnaB Pl的核酸序列如SEQ ID NO. 1 所示，所述RA DnaB P2的核酸序列如SEQ ID NO. 2所示，所述E. coli phoA Pl的核酸序列如SEQ ID NO. 3所示，所述E.coli phoA P2的核酸序列如SEQ ID NO. 4所示，所述 Salm invA ...

【专利技术属性】
技术研发人员：于圣青，胡青海，韩先干，丁铲，仇旭升，宋翠萍，
申请(专利权)人：中国农业科学院上海兽医研究所，
类型：发明
国别省市：31