本发明专利技术公开了一种检测牛瓜氨酸血症有害基因的方法及其专用引物。本发明专利技术提供的检测瓜氨酸血症有害基因的引物组合物，包括序列表中序列1所示的引物1、序列表中序列2所示的引物2和序列表中序列3所示的引物3。采用本发明专利技术的专用引物对瓜氨酸血症(CN)有害基因的携带者和正常个体(非CN有害基因携带者)分别进行AS-PCR检测，实验证明：AS-PCR扩增分型结果和测序结果与预期没有偏差，说明特异性引物的扩增特异性很高，可以分辨单碱基变化；且内标条带也能够指示DNA和PCR体系质量，排除假阴性存在的可能性，说明本发明专利技术试剂盒检测CN有害基因的准确性很高。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种检测牛瓜氨酸血症有害基因的方法及其专用引物。
技术介绍
随着人工授精和胚胎移植技术在奶牛育种中的应用，种质产品(个体、冻精、胚胎等)在世界范围内广泛流通，使得优秀公牛种质资源充分利用。但在获得优秀生产性能的同时，往往会将遗传疾病也进行扩散，尤其是常染色体隐性遗传疾病。常染色体单基因隐性遗传病是由常染色体上的一对等位基因控制的，只有在该基因为隐性纯合的基因型时，个体才会患病。而隐性有害基因携带个体表型正常，但是其一旦与携带者交配，就会有0. 25的可能性出现患病个体，而且携带者个体即使与正常个体交配，也会有0. 5的可能性将有害基因传递给后代。这种特点导致它传播有害基因的几率非常大。一旦种用个体为常染色体有害基因的携带者，并且有良好的生产性能，在盲目追求提高生产性能的目的下，广泛利用其种用价值，就会导致有害基因的大面积扩散。瓜氨酸血症(citrullinemia，CN)最早由Harper等在澳大利亚荷斯坦牛群中发现的一种常染色体单基因隐性遗传疾病。其分子遗传学基础是奶牛11号染色体 (BTAll)上精氨酸合成酶(argininosuccinate synthetase, ASS)基因编码的第86个氨基酸密码子发生无义突变(CGA — TGA)，终止信号提前出现，从而使成隐性纯合个体 ASS 功能缺失(Dennis J A, Healy P J, Beaudet A L, et al. Molecular Definition of BovineArgininosuccinate Synthetase Deficiency.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United Statesof America, 1989,86 :7947-7951. )。ASS参与肝脏的尿素循环，尿素循环受阻导致氨代谢障碍，使得血液中瓜氨酸浓度升高，个体产生氨中毒的现象。隐性纯合子犊牛一般在M小时内开始发病，出现精神沉郁、食欲下降、以头顶墙等逐渐加重的神经症状，最后死亡。病理学研究发现患病个体大脑皮层受到不同程度的损伤，犊牛从出生到发病再到死亡的全过程不超过一周(Harper P A W,Healy P J,Dennis J A. Animal Model of Human Disease-Citrullinemia(Argininosuccinate Synthetase Deficiency). American Journal of Pathology, 1989,135 :1213-1215 ；Healy P J,Harper P A W, Dennis J A. Bovine Citrullinaemia-A Clinical, Pathological, Biochemical and GeneticStudy. Australian Veterinary Journal 1，1990，67 :255_258.)。 _ 力禾O 亚科学家通过系谱分析发现几乎所有CN患病犊牛都可以追溯到一个共同祖先-澳大利亚优秀种公牛Linmack CrissKing，其致病基因来自它的父亲Gray View Crisscross。 Linmack Criss King公牛由于其女儿在乳脂率上的良好表现，其冻精在澳大利亚、新西兰等英联邦国家广泛使用，产生很多携带者后代(Healy PJ, Harper P A W, Dennis J A.Bovine Citrullinaemia-A Clinical， Pathological， Biochemical and Genetic Study. Australian Veterinary Journal 1，1990,67 :255-258 ；Healy P J，Dennis J A.， Camilleri L M，et al. Bovine Citrullinaemia Traced to the Sire of Linmack Kriss King. Australian VeterinaryJournal 1，1991,68 :155.)。目前对CN的分子检测方法主要是PCR-RFLP，其主要内容是1.围绕突变位点设计上下游引物，进行分析片段的扩增。2.利用限制性内切酶Avail消化扩增片段。3.将消化好的片段进行琼脂糖电泳检测分型。如果原扩增片段不被Avail消化成更小的片段，说明存在着有害基因。PCR-RFLP方法虽比较准确实用，但仍存在一定的假阳性，需要重复验证并结合系谱和测序结果进一步验证。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种引物组合物。本专利技术提供的检测瓜氨酸血症有害基因的引物组合物，包括序列表中序列1所示的引物1、序列表中序列2所示的引物2和序列表中序列3所示的引物3。序列1所示的引物1由19个核苷酸组成，其对应于序列表中序列6所示的第66 位-84位；其中序列1的第15位是碱基T、这样人为错配防止引物间配对用；序列1的第19 位是碱基T，是对应序列6第84位的碱基C突变成的T。序列2所示的引物2由17个核苷酸组成，其对应于序列表中序列6所示的第68 位-84位；其中序列1的第13位是碱基T、这样人为错配防止引物间配对用。进一步讲，上述瓜氨酸血症有害基因可以是精氨酸合成酶基因的第86个氨基酸密码子发生无义突变的基因，该有害基因的第4个外显子的核苷酸序列优选如序列表中序列6所示。更进一步讲，上述引物组合物是由序列表中序列1所示的引物1、序列表中序列2 所示的引物2和序列表中序列3所示的引物3组成。在另一实施例中，上述引物组合物是由序列表中序列1所示的引物1、序列表中序列2所示的引物2、序列表中序列3所示的引物3、序列表中序列4所示的引物4和序列表中序列5所示的引物5组成，其中所述引物4和引物5为一对内标引物。上述引物1和引物3为整体包装、引物2和引物3为整体包装，或所述引物1、引物 2和引物3分别单独包装。优选地，上述引物1、引物2和引物3的摩尔比为1 1 2。一种含有上述的引物组合物的试剂盒也属于本专利技术的保护范围之内。上述的引物组合物或上述的试剂盒在检测牛瓜氨酸血症有害基因中的应用也属于本专利技术的保护范围之内。上述应用是通过等位特异性PCR进行检测的，所述等位特异性PCR包括两轮PCR 扩增。上述两轮PCR扩增的1个PCR体系中引物1、引物3的终浓度均为0. 4μ mol/L ；另 1个PCR体系中引物2、引物3的终浓度均为0. 4 μ mol/L。本专利技术的试剂盒是采用等位特异性PCR的方法(AS-PCR)，它是一种比较简单的单碱基位点分型的方法，它通过根据突变位点设计两条3，末端与突变位点分别一致的特异性引物和突变点另一边的公共引物，特异性引物只能与3，末端碱基严格配对的模板结合，并扩增出相应产物，而不配对的模板不被扩增。这样通过两轮不同特应性引物的PCR扩增，就能知道模板链的碱基组成。从而对位点进行分型。本专利技术的试剂盒进行AS-PCR与PCR-RFLP 结果比较，其结果更准确有效。用本专利技术的试剂盒筛查荷斯坦奶牛瓜氨酸血症(CN)有害基因的携带者时，可以待测荷斯本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种检测瓜氨酸血症有害基因的引物组合物，包括序列表中序列１所示的引物１、序列表中序列２所示的引物２和序列表中序列３所示的引物３。
【技术特征摘要】
2011.03.04 CN 201110051975.31.一种检测瓜氨酸血症有害基因的引物组合物，包括序列表中序列1所示的引物1、序列表中序列2所示的引物2和序列表中序列3所示的引物3。2.如权利要求1所述的引物组合物，其特征在于所述瓜氨酸血症有害基因是精氨酸合成酶基因的第86个氨基酸密码子发生无义突变的基因。3.如权利要求1或2所述的引物组合物，其特征在于所述引物组合物是由序列表中序列1所示的引物1、序列表中序列2所示的引物2和序列表中序列3所示的引物3组成。4.如权利要求1或2所述的引物组合物，其特征在于所述引物组合物是由序列表中序列1所示的引物1、序列表中序列2所示的引物2、序列表中序列3所示的引物3、序列表中序列4所示的引物4和序列表中序列5所示的引物5组成...
【专利技术属性】
技术研发人员：孙东晓，谢岩，张沅，张毅，杨鸣洲，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：11
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