一种现场测定发酵样品中苯乳酸含量的检测方法技术

本发明专利技术涉及一种现场测定发酵样品中苯乳酸含量的检测方法：样品预处理后用气相色谱分析测定；样品预处理为：取液态发酵样品或粉碎后的固态发酵样品加去离子水混匀，然后将样品加热蒸干，再加去离子水振荡后离心，取上清液加热除去水分，加3.0－3.4mol/L的浓盐酸-正丁醇混合液0.2－0.5mL，于65－72℃保温12－15min，用氮气吹干；再加入体积比0.15－0.3：1的三氟乙酸酐-乙酸乙酯混合液0.2－0.5mL，于78－85℃保温12－15min，用氮气吹干；加乙酸乙酯使其溶解，离心后取上清液进行检测。该方法检测灵敏度高，苯乳酸最低检出限为4.2×10-7g/mL。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物防腐剂检测
，具体涉及一种适用于工业化现场测定发酵样品中苯乳酸含量的检测方法。
技术介绍
苯乳酸(phenyllactic acid，PLA)，也称3_苯基乳酸或β -苯乳酸，即2_羟基-3-苯基丙酸，是近年来人们发现的乳酸菌等微生物产生的一种新型小分子抗菌物质， 对多种食源性致病菌、导致食品变质的腐败菌包括产生毒素的丝状真菌有很强的抑菌作用。苯乳酸是一种天然、广谱的新型生物食品防腐剂。现在大多数食品企业使用的食品防腐剂仍然是以苯甲酸钠、山梨酸钾等为代表的化学防腐剂。但是由于人们生活水平的不断提高和对食品安全的日益重视，消费者要求降低化学防腐剂的使用、追求安全性高的天然食品，这使得具有天然、广谱、低毒的生物防腐剂成为食品工业中的重要发展方向。生物防腐剂的生产已经成为防腐剂工业重要的组成部分，工业化发酵生产苯乳酸的时代即将带来。目前报道的检测方法有薄层层析法、毛细管电泳法、高效液相法等。薄层层析只能定性和半定量检测苯乳酸，而工业化发酵生产苯乳酸，需要对发酵样品中苯乳酸进行准确定量检测。毛细管电泳法使用的毛细管直径小，容易使光路太短，灵敏度较低，而且在电渗时会因样品组成而变化，影响结果的重现性。高效液相法由于设备的局限，不便于进行现场检测。目前还没有文献报道利用气相色谱法检测发酵产品中苯乳酸含量。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种适用于工业化现场测定发酵样品中苯乳酸含量的检测方法。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案，该方法为发酵样品经预处理后用气相色谱进行分析测定；所述样品预处理过程为①取2— 5mL液态发酵样品，或者1 一 3g粉碎后的固态发酵样品加去离子水混勻(固态发酵样品需加去离子水混勻，液态发酵样品无需加去离子水)；②把上述样品加热蒸干(固态样品加热目的是将苯乳酸从样品颗粒内部浸提到外部， 液态样品加热是使发酵液中的蛋白质成分变性沉淀，以便于除去)，再加去离子水2 - 5mL 振荡(用以溶解苯乳酸)后离心，取上清液加热除去水分；③加入浓度3.0 — 3. 4mol/L的浓盐酸-正丁醇混合溶液(其用市售浓度37%浓盐酸与正丁醇混合配制而成，IL正丁醇中含有3. 0 — 3. 4mol氯化氢，下同)0. 2 一 0. 5mL,于65 — 72°C保温12 - 15min，用氮气吹干；④再加入体积比0.15 — 0. 3 :1的三氟乙酸酐-乙酸乙酯混合溶液0. 2 — 0. 5mL,于 78 - 85°C保温12 - 15min，用氮气吹干；加乙酸乙酯(加入量一般为1 一 ^il)使其溶解，3离心后取上清液进行检测。优选的，所述上清液加热除去水分后加浓度3. Omol/L的浓盐酸-正丁醇混合溶液0. 3mL，于70°C保温15min，用氮气吹干；再加入体积比0. 3 1的三氟乙酸酐-乙酸乙酯混合溶液0. 3mL,于80°C保温15min，用氮气吹干。检测时，使用的气相色谱条件为色谱柱DB-1，内径15mX0. 53πιπι，3.0μπι膜厚的石英毛细管柱，内涂100%二甲基聚硅氧烷；柱温采用程序升温，初始温度小于80°C，保持3 - %iin，然后从初始温度升至116°C，升温速度5 — 7°C /min，再从116°C升至250 — 280 0C，升温速度30 - 50 0C /min ；进样器温度250 — 270 °C，检测器温度270 — 300 °C，气流速度氮气 8 - 12mL/min，氢气 38 — 42 mL/min,空气 380 — 420 mL/min，分流比为 25 — 30:1 ；尾吹流速15 — 18mL/min。柱温采用程序升温，较好的，初始温度为80°C，保持％iin，然后从80°C升至116°C， 升温速度6°C /min，再从116°C升至250°C，升温速度45°C /min ；进样器温度250°C，检测器温度280°C，气流速度氮气10mL/min，氢气40 mL/min，空气380 mL/min，分流比为30:1 ； 尾吹流速18mL/min。与现有技术相比，本专利技术方法能够灵敏、准确地测定发酵产品中的苯乳酸含量，检测灵敏度高，苯乳酸(含D型和L型)的最低检出限为4. 2XioVmL,另外还可以结合市售的便携式加热器(如MiniT迷你金属浴)、便携式离心机(如MinKtar微型迷你离心机)、 Micro-GC便携式气相色谱仪等设备，实现工业化发酵生产中苯乳酸的现场检测，为苯乳酸发酵生产过程中的监测提供了一种有效的检测方法，便于优化控制发酵条件获取最大产量的苯乳酸。附图说明图1是苯乳酸标准样品的检测结果图(苯乳酸的出峰时间为9. 605分)； 图2是苯乳酸标准曲线；图3是毛地霉固态发酵样品a的检测结果图； 图4是植物乳杆菌液态发酵样品b的检测结果图。具体实施例方式以下通过实施例对本专利技术进行详细说明，但本专利技术的保护范围不限于此。实施例1苯乳酸标准曲线用Alfa Aesar公司生产的苯乳酸配制成浓度ang/mL的苯乳酸标准溶液。取2mL标准溶液加热除去水分，再加3. Omol/L浓盐酸-正丁醇混合溶液0. 3mL，振荡后密闭加热到 70°C保持15 min,N2吹干残余溶液。再加入体积比0. 3 :1的三氟乙酸酐-乙酸乙酯混合液 0. 3 mL，振荡后密闭加热至80°C保持15 min,N2吹干残余溶液。加入ImL乙酸乙酯，振荡后离心5-7min，取上清用乙酸乙酯稀释成浓度分别为100、400、700、1000、1400 μ g/mL(以苯乳酸计)，分别取1μ 1 (即苯乳酸含量分别为100、400、700、1000、1400ng)进样，第一个标准品 (即含苯乳酸IOOng)的气相色谱结果如图1所示(苯乳酸的出峰时间为9. 605分，峰面积为 2281)。根据各不同浓度的峰面积制作标准曲线，见图2。本专利技术选用Agilent 6820气相色谱仪，氢火焰离子化检测器。色谱条件色谱柱DB-I，内径15mX0. 53mm，3. 0 μ m膜厚的石4英毛细管柱，内涂有100% 二甲基聚硅氧烷；柱温采用程序升温，初始80°C，保持％iin，8(TC 升至 116°C，6°C /min，116°C升至 250°C，45°C /min ；进样器温度 250°C，检测器温度 280°C， 气流速度氮气10mL/min，氢气40mL/min，空气380mL/min，分流比30:1 ；尾吹流速18mL/ min。标准曲线以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标作图(见图2)ng:10040070010001400峰面积2281 9260 171552454234780R2=O. 9997 a= -467. 59 b=25.099 实施例2以现场检测毛地霉固态发酵样品a为例。样品预处理取2g粉碎后的毛地霉固态发酵样品，加去离子水2mL，上下颠倒振荡数次后以使与水充分混勻，加热蒸干，加去离子水:3m L振荡(用以溶解苯乳酸)后离心，取上清加热除去水分，加3. Omol/L浓盐酸-正丁醇混合溶液0. 3mL，振荡后密闭加热到70°C保持15 min, N2吹干残余溶液。再加入体积比0. 3 :1的三氟乙酸酐-乙酸乙酯混合溶液0. 3 mL，振荡后密闭加热至80°C保持本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种现场测定发酵样品中苯乳酸含量的检测方法，其特征在于，发酵样品经预处理后用气相色谱进行分析测定；所述样品预处理过程为：①取２－５ｍＬ液态发酵样品，或者１－３ｇ粉碎后的固态发酵样品加去离子水混匀；②把上述样品加热蒸干，再加去离子水２－５ｍＬ振荡后离心，取上清液加热除去水分；③加入浓度３．０－３．４ｍｏｌ／Ｌ　的浓盐酸－正丁醇混合溶液０．２－０．５ｍＬ，于６５－７２℃保温１２－１５ｍｉｎ，用氮气吹干；④再加入体积比０．１５－０．３：１的三氟乙酸酐－乙酸乙酯混合溶液０．２－０．５ｍＬ，于７８－８５℃保温１２－１５ｍｉｎ，用氮气吹干；加乙酸乙酯使其溶解，离心后取上清液进行检测。

【技术特征摘要】
1.一种现场测定发酵样品中苯乳酸含量的检测方法，其特征在于，发酵样品经预处理后用气相色谱进行分析测定；所述样品预处理过程为①取2- 5mL液态发酵样品，或者1 一 3g粉碎后的固态发酵样品加去离子水混勻；②把上述样品加热蒸干，再加去离子水2- 5mL振荡后离心，取上清液加热除去水分；③加入浓度3.0 — 3. 4mol/L的浓盐酸-正丁醇混合溶液0. 2 — 0. 5mL,于65 — 72 °C 保温12 - 15min，用氮气吹干；④再加入体积比0.15 — 0. 3 :1的三氟乙酸酐-乙酸乙酯混合溶液0. 2 — 0. 5mL,于 78 - 85°C保温12 - 15min，用氮气吹干；加乙酸乙酯使其溶解，离心后取上清液进行检测。2.根据权利要求1所述现场测定发酵样品中苯乳酸含量的检测方法，其特征在于所述上清液加热除去水分后加浓度3. Omol/L的浓盐酸-正丁醇混合溶液0. 3mL，于70°C保温 15min，用氮气吹干；再加入体积比0. 3 1的三氟乙酸酐-乙酸乙酯混合溶液0. 3mL，于80°C 保温15min，用氮气吹干。3.根据权利要求1或2所述现场测定发酵样品中苯乳酸含量的检测方法，...

【专利技术属性】
技术研发人员：王永，李向力，王法云，田春华，吕微，
申请(专利权)人：河南省商业科学研究所有限责任公司，
类型：发明
国别省市：41