黄瓜细菌性角斑病菌检测用引物制造技术

本发明专利技术提供了一种黄瓜细菌性角斑病菌检测用引物，所述引物的核苷酸序列如序列表PSL-F&PSL-R所示。本发明专利技术还进一步提供了检测黄瓜细菌性角斑病菌的方法，该方法以样品菌液或者植物提取DNA为模板，利用上述引物进行PCR扩增，扩增结束后用凝胶电泳可检测到179bp的扩增片段。本发明专利技术引物特异性好，灵敏度高，为黄瓜种子进出口安全提供了保证。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物检测技术，具体地说涉及黄瓜细菌性角斑病菌检测用引物。
技术介绍
黄瓜细菌性角斑病菌(Pseudomonas syringae pv. lachrymans)是世界性黄瓜病害，主要侵染黄瓜，该病菌在种子内、外或随病残体在土壤中越冬，远距离传播主要依靠带菌种子。该病目前在世界各地均有分布，在我国主要分布在华北、东北及华中地区。近年来我国黄瓜种植面积不断增大，黄瓜育种产业发展很快，黄瓜种子远距离调运的频次及数量也大幅度增加，因此该病传播及扩散的风险日益增大。本研究选择黄瓜细菌性角斑病菌gapl基因设计一对引物，建立了黄瓜细菌性角斑病菌的PCR检测方法，反应结束后利用凝胶电泳检测判定是否有黄瓜细菌性角斑病菌。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供用于黄瓜细菌性角斑病菌PCR检测用引物序列。本专利技术通过分析黄瓜细菌性角斑病菌gapl基因序列的基础上，设计了引物。所述的引物对由正向和反向引物组成，其核苷酸序列如序列表PSL-F和PSL-R所示。本专利技术还进一步给出了应用上述引物进行PCR检测的方法，其以样品菌液或者植物提取DNA为模板，进行PCR扩增，反应结束后根据电泳检测扩增片段判定结果。具体地说本专利技术以样品菌液或者植物提取DNA为模板，进行PCR反应，即在25 μ L 反应体系中加入 18. 3 μ L 超纯水，IOXPCR buffer2. 5 μ L，1 μ L 引物 PSL-F(20 μ mol/L)， 1 μ L 引物 PSL-R(20 μ mol/L)，(10mmol/L) dNTP 1 μ L，模板 1 μ L，空白对照加 1 μ L超纯水代替模板，Taq DNA聚合酶(5U/ μ L) 0. 2 μ L。其中，上述反应条件可以是94°C 5min ；94°C 30S， 58°C 30S，72°C 30S，35 个循环；72°C 8min。进一步，还可以将本专利技术引物及相关试剂组装成试剂盒，以方便使用。本专利技术根据黄瓜细菌性角斑病菌gapl基因序列设计引物，该引物特异性好，用于 PCR检测灵敏性高。本专利技术检测方法准确性高、灵敏度高，其能够快速简单地判断样品是否有黄瓜细菌性角斑病菌，为黄瓜种子进出口安全提供了保证。附图说明图1 本专利技术检测方法对黄瓜细菌性角斑病菌检测的实验结果所有参试的12株黄瓜细菌性角斑病菌均能扩增出单一的179bp的电泳条带。图 1中M =Marker DL2000 ；1-10分别为来源于NCPPB菌种保藏中心的黄瓜细菌性角斑病菌， NCPPB 编号分别为 540，541，542，543，277，467，1425，1428，1096，1097 ；条带 11 及 12 为 2 株吉林分离物；13为空白对照。图2是本专利技术检测方法的灵敏度实验结果。图 2 中 M =Marker DL2000，1—7 分别为:7. 5X 107、7. 5X 106、7. 5X 105、7. 5X 104、7. 5Χ103、7· 5Χ102、7· 5X IO1J. 5X 10°cfu/mL,8 空白对照，结果显示 7. 5X103cfu/mL 以上浓度菌液均可观察到电泳条，空白对照无条带。经过换算，本检测方法最低检测限大约是 7. 5个细菌。图3是本专利技术检测方法对黄瓜叶片的检测应用实验。图3中M为Marker DL2000 ； 1-3为NCPPB 540菌株及2个吉林分离菌株接种黄瓜叶片后提取DNA扩增条带；4为健康黄瓜植株叶片提取的DNA ；5为空白对照。具体实施例方式下面实施例用于对本专利技术的进一步说明，但不用来限制本专利技术的范围。实施例1引物的设计与合成根据黄瓜细菌性角斑病菌gapl基因序列，利用I^rimer Premier5.0软件设计引物，引物序列为PSL-F (正向)5 ‘ -GTTCGGCGACGCAATCAATG-3 ‘ PSL-R (反向)5 ‘ -GTTGACTTCTTCGGCGGTGG-3 ‘实施例2PCR扩增方法的建立1、PCR反应体系以菌液或者植物提取DNA为模板，进行PCR反应，即在25 μ L反应体系中加入 18.3yL 超纯水，2· 5μ L10XPCR buffer, 1 μ L 弓 | 物 PSL-F (20 μ mol/L)，1 μ L 弓 | 物 PSL-R (20 μ mol/L)，1 μ L dNTP (10mmol/L)，1 μ L模板，空白对照加1 μ L超纯水代替模板， TaqDNA 聚合酶(5U/ μ L) 0. 2 μ L。2、PCR反应条件PCR 反应条件94°C 5min ；94°C 30S, 58°C 30S, 72°C 30S, 35 个循环；72°C 8min。实施例3黄瓜细菌性角斑病菌PCR方法的特异性确定以 10 株来源于 NCPPB 菌种保藏中心的 Pseudomonas syringae pv. Iachrymans R 2吉林分离菌株为模板，进行PCR扩增检测。所有P. syringae pv. Iachrymans均在179bp 扩增出条带，空白对照无条带，说明该方法能够检测到所有收集到的黄瓜细菌性角斑病菌。2、以黄瓜细菌性角斑病菌(NCPPB 540)为阳性对照，以收集到的P. Syringae不同致病变种、Pseudomonas属的不同种及Erwinia等不同属的参试菌株(具体见表1)为做模板进行PCR扩增，结果只有阳性对照有扩增条带，其余均无扩增条带，证明了该检测方法的特异性。实施例4灵敏度实验将浓度为7. 5X 107cfu/mL 的(NCPPB 540)菌株分别稀释成 7. 5X 106、7· 5X 105、 7. 5X104、7. 5X103、7. 5X102、7. 5X101、？. 5X10°、cfu/mL 共 8 个浓度梯度，结果显示 7. 5 X IO3以上浓度度均可观察到电泳条，经过换算，本检测方法最低检测限大约是7. 5个细菌。实施例5黄瓜细菌性角斑病菌PCR方法的应用实验以接种黄瓜细菌性角斑病菌并表现症状的黄瓜叶片总DNA为模板，以健康叶片为对照，结果发现接种叶片可观察到明显的目标片段，而健康对照及空白对照均无目标片段。表本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种黄瓜细菌性角斑病菌检测用引物，其核苷酸序列为：ＰＳＬ－Ｆ：５′－ＧＴＴＣＧＧＣＧＡＣＧＣＡＡＴＣＡＡＴＧ－３′ＰＳＬ－Ｒ：５′－ＧＴＴＧＡＣＴＴＣＴＴＣＧＧＣＧＧＴＧＧ－３′

【技术特征摘要】
1.一种黄瓜细菌性角斑病菌检测用引物，其核苷酸序列为 PSL-F 5‘ -GTTCGGCGACGCAATCAATG-3‘PSL-R 5‘ -GTTGACTTCTTCGGCGGTGG-3‘2.一种检测黄瓜细菌性角斑病...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵文军，王哲，李志红，朱水芳，陈洪俊，
申请(专利权)人：中国检验检疫科学研究院，中国农业大学，
类型：发明
国别省市：11