生物指示物制造技术

将激酶用在生物指示物中，用于验证设计用来降低样品中生物因子的量或活性的处理过程。可以将指示物用于验证灭菌处理。从包含ADP的底物形成ATP是通过发光计中的萤光素/萤光素酶系统得以测定。来自嗜酸热硫化叶菌的热稳定腺苷酸激酶特别适合用于验证失活传染性海绵状脑病(TSE)因子的步骤。

【技术实现步骤摘要】
生物指示物本申请为分案申请，原申请的申请日为2005年3月22日，申请号为200580009130. 0(PCT/ GB2005/001056)，专利技术名称为“生物指示物”。本专利技术涉及生物指示物，一般而言，其适于验证一种过程，包括基于热的失活过程和失活步骤，更具体地，其适于验证失活传染性海绵状脑病(transmissible spongiform encephalopathy) (TSE)因子的步骤。克-雅综合征(Creutzfeldt-Jakob Disease) (CJD)是一种相对罕见的人类神经变性疾病形式，以家族性、散发性或医源性疾病存在，发病率是每百万人群中大约1例。该疾病的一个新的变种形式(vCJD)的出现-其主要发生在年轻人群中并且可能是由于消费了受牛海绵状脑病(BSE)感染的肉类产品，增加了病例数大量增加的概率。这些因素具有重要的公共健康意义。在二十世纪八十年代晚期，高比例的英国人群曾经通过食物潜在地暴露于该疾病。尽管迄今为止的病例数相对低(至2004年2月是149例)，仍然存在着对来自通过其它传播途径，包括手术、移植、输血或污染的医疗用品的所有形式CJD的显著风险。这些途径中的许多涉及该疾病在临床情况中的医源性传播，其它途径在动物模型中得到确定。在人类中引起所有形式CJD的因子对应用标准方法的失活是高度抵抗的。迫切需要对外科器械除污染的有效方法。已经对多种处理，包括化学处理和利用湿热或干热的高温及高压的应用进行了测试，但是没有一种方法是满足要求的[Taylor，D. Μ. (1999) 于Principles andpractice of disinfection, preservation and sterilisation 中.(Russell, A. D.，Hugo, W. B. and Ayliffe, G. A. J.，Eds) :pp 222-236Blackwel 1 ScientificPublications, Oxford ；Taylor, D. M. . (2001)Contrib Microbiol. 7,58-67 ； Taylor, D. Μ. , Fernie, K, Steele, PJ. , McConnel1, I. and Somerville, R. A. (2002)J Gen Virol. 83, 3199-3294] 焚烧是有效的，但是阻碍了对原材料和或器械的任何恢复或再利用。已经显示，高浓度氢氧化钠(高达2M)或高水平次氯酸钠(高达20000ppm)的应用明显降低TSE因子的水平，但是其对外科器械具有损害效应，并且对操作者有害。已经提议了多种其它方法作为失活外科器械上的TSE因子的方法，这些方法目前还在开发中。这些包括多种气态杀菌剂，包括蒸气态过氧化氢、臭氧和环氧乙烷。已经提议了其它方法作为常规灭菌之前特定的抗TSE预处理，这些方法包括在限定的pH条件和温度条件下，用热稳定蛋白酶处理外科器械。嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)芽孢的失活是常规用于验证高压灭菌之正确实施的方法。这种指示物可以给出细菌或病毒被该过程失活的相对指示， 以该过程通常由于降低了感染因子水平IO6个数量级而得到验证。然而，TSE因子独特的稳定性质意味着需要强得多的指示物来提供对失活这种因子的过程的性能的相对指示。基于热稳定芽孢或酶制备物的其它生物指示物是熟悉本领域技术人员公知的。这些指示物都有缺点它们不能验证感染因子活性降低超过IO6的失活。TSE因子的失活也是处理受牛海绵状脑病(BSE)感染物质和制备动物来源的原材料中的重要问题。现在存在可靠的科学根据，认为BSE的发生和传播是通过炼油操作中的转变形成的，高度感染的神经组织被通过肉骨粉添加剂(meat-and-bone-meal supplements)反过来喂给牲畜。也有可靠证据表明，BSE是vCJD的病因，几乎确定地是食用污染的牛肉产品的结果。由于这个原因，死于BSE的任何牲畜，以及所有牲畜的脊髓和脑组织，通常从食物链中被去除，并且经可选的途径被处理。其结果是，大量的动物废物目前被积累或经焚烧处理。用热稳定蛋白酶对这些物质进行处理是一个可能的解决方法。此外， 存在着对确保任何感染物在适当的过程中被摧毁的验证方法的需求。本专利技术的一个目的是，提供可选的和/或改进的生物指示物以及它的应用。因此，在本专利技术的第一方面，提供了生物过程指示物(biologicalprocess indicator)，用于验证旨在降低样品中生物因子的含量或活性的处理过程，其包括激酶。在一个优选实施方案中，指示物还包括固体支持物，其中的激酶被固定化在所述固体支持物中或被固定化在所述固体支持物上。在一个特别优选的实施方案中，激酶是热稳定激酶。在本专利技术的应用中，生物指示物被包含在待接受处理的样品中，所述处理意图在于降低样品中的潜在污染物，特别是传染因子的含量。从以前的试验已知，处理所致指示物激酶活性的降低与污染物的量或活性的降低相关。为了确定污染物的量/活性是否被降低至可接受水平以下，在处理之前和之后，或在处理过程中测定指示物激酶的活性。当达到已知与污染物中的可接受降低相关的活性水平时，则认为该处理是有效的。如果污染物是感染因子，则认为样品是无菌的。在本专利技术的一个特殊应用中，热稳定激酶是指示一种因子(例如，感染因子)在清洁步骤或失活步骤之后可能存在的方法中的报告物。首先，含有热稳定的腺苷酸激酶、乙酸激酶或丙酮酸激酶的样品被暴露于清洁/失活程序(例如，选择的温度、PH值或蛋白酶浓度中的一种或多种)。随后的步骤是通过热处理去除任何污染的酶活性，例如，在60至80°C， 至少10分钟(S卩，在不明显影响热稳定激酶的条件下)。随后使热稳定激酶在30°C至70°C 与底物(例如ADP)反应，使得ATP产生。ATP的形成可以通过生物发光检测而测定，其中应用萤光素/萤光素酶和合适的发光计，在20-30°C测定10分钟至1小时。发光计的读数给出了残余激酶活性，即，暴露于清洁/失活处理后的激酶活性的读数。根据以前的单独试验得到的数据，该方法通过将残余激酶活性与被处理样品中的传染因子的可能性存在相关联而完成。 在一种实施方案中，在指示物加入之前，样品中的污染性酶活性或ATP可以通过起始处理步骤(例如，选择的温度、PH值或蛋白酶浓度)被去除。 已经发现激酶能够产生可以在极宽范围内检测的信号。一般而言，激酶是应用含有ADP的底物被检测的，ADP转变为ATP，ATP本身被用于产生光，例如，应用萤光素/萤光素酶，用发光计检测。宽范围使得指示物特别适于验证，原因是激酶甚至在量/活性降低许多个对数级时保持可检测。对于灭菌，大多数国家机构(national institutes)认为生物因子的量或活性降低6个对数级是验证灭菌状态所需的。本专利技术的激酶提供了验证因子的量或活性的降低程度充分超过6个对数级、至8个对数级和更多的潜能，因而增加了目前提供的监测范围。在本专利技术的优选实施方案中，激酶是热稳定的，因此适于在验证高温下进行的过程中应用。也发现热稳定激酶对其它极端环境具有抗性，并且例如，通常发现其对极端 PH值具有抗性和对暴露于蛋本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．热稳定激酶作为确认降低样品中或样品上污染生物因子的量或活性的处理过程的指示物的用途：其中所述热稳定激酶是腺苷酸激酶、乙酸激酶或丙酮酸激酶；其中所述生物因子选自细菌、病毒、芽孢、蛋白质、肽和朊病毒；其中所述处理过程包括所述样品和所述热稳定激酶暴露于选择的ｐＨ值、压力、酶、去污剂、化学灭菌剂、气相灭菌剂或者利用湿蒸气或干蒸气的高温高压灭菌中的一种或多种；以及其中在使用时，所述激酶和所述生物因子均被直接暴露于所述处理过程。

【技术特征摘要】
2004.03.22 GB 0406427.51.热稳定激酶作为确认降低样品中或样品上污染生物因子的量或活性的处理过程的指示物的用途其中所述热稳定激酶是腺苷酸激酶、乙酸激酶或丙酮酸激酶；其中所述生物因子选自细菌、病毒、芽孢、蛋白质、肽和朊病毒；其中所述处理过程包括所述样品和所述热稳定激酶暴露于选择的PH值、压力、酶、去污剂、化学灭菌剂、气相灭菌剂或者利用湿蒸气或干蒸气的高温高压灭菌中的一种或多种； 以及其中在使用时，所述激酶和所述生物因子均被直接暴露于所述处理过程。2.根据权利要求1的用途，其中所述激酶催化由含ADP底物形成ATP。3.根据权利要求1或2的用途，其中所述激酶是三腺苷酸激酶或单腺苷酸激酶。4.根据权利要求3的用途，其中所述激酶是三腺苷酸激酶。5.根据权利要求3的用途，其中所述激酶是硫化叶菌各种三腺苷酸激酶或Thermotoga sp.单腺苷酸激酶。6.根据权利要求1的用途，其中所述激酶是来自下列的腺苷酸激酶酸热脂环酸芽孢杆菌、A. fulgidus、敏捷气热菌、嗜火产液菌、B. caldotenax BT1、杆菌属种PS3、嗜热脂肪芽孢杆菌 11057、嗜热脂肪芽孢杆菌 12001、B. thermocatenulatus、C. stercocorarium、甲烷球菌各种、M. ruber、P. abyssi、激烈热球菌、P. horikoshii、沃氏热球菌、R. marinus、嗜酸热硫化叶菌、芝田硫化叶菌、S. solfataricus、产乙醇热厌氧杆菌、T. thermosulfurogenes、 Τ. celere、Τ. litoralis、水生栖热菌 YT1、Τ. caldophilus GK24、嗜热栖热菌 HB8、 T. maritima gJc Τ. neapolitBnB07.根据权利要求1-6的任一项的用途，其中在所述处理过程之前，所述热稳定激酶的所述激酶活性被限定为在所述样品和热稳定激酶暴露于70°C 30分钟使嗜温性激酶失活的起始步骤后残余的激酶活性。8.根据权利要求1-7的任一项的用途，其中在所述样品和热稳定激酶起始暴露于 700C 30分钟使嗜温性激酶失活后，所述热稳定激酶保留至少500，000相对光单位/mg激酶的激酶活性，是在萤光素/萤光素酶存在的情况下，通过发光计测定的。9.根据权利要求1-8的任一项的用途，其中所述激酶被固定化在固体支持物中或固定化在固体支持物上。10.根据权利要求9的用途，其中所述固体支持物是基质，所述激酶被分散在所述基质中。11.根据权利要求10的用途，其中所述固体支持物包括聚合物基质。12.根据权利要求9-11中任一项的用途，其中所述固体支持物是指示条、蘸棒或珠子。13.根据前述任一项权利要求的用途，其中所述指示物还包括稳定所述激酶的试剂。14.根据权利要求13的用途，其中所述稳定剂选自金属离子、糖、糖醇和凝胶-形成剂。15.根据权利要求9-14中任一项的用途，还包括将所述支持物连接于表面的手段。16.根据前述任一项权利要求的用途，其中所述生物因子是传染性海绵状脑病。17.根据前述任一项权利要求的用途，其中所述处理过程包括(i)暴露于至少9的pH、 ( )暴露于蛋白酶、或(iii)暴露于103千帕的压力和121°C的温度中的一种或多种。18.根据前述任一项权利要求的用途，其中所述处理过程包括，在至少60°C的温度下和至少为9的pH下，将所述样品暴露于热稳定蛋白酶。19.根据前述任一项权利要求的用途，其中所述激酶具有选自SEQIDNos:l-25的氨基酸序列，或由选自SEQ ID Nos 26-30的核酸序列编码。20.热稳定激酶氨基酸序列，其选自SEQID Nos 17-19。21.包含热稳定激酶氨基酸序列的生物过程指示物，其中所述氨基酸序列选自SEQID Nos :17-19。22.生物过程指示物，其包括 (i)热稳定激酶，其中所述激酶是腺苷酸激酶、乙酸激酶或丙酮酸激酶；和( )固体支持物，其选自(a)指示条、蘸棒、珠子或基质，其中所述激酶被固定化在所述固体支持物内，或被共价偶联到所述固体支持物上；或者(b)基质，其中所述激酶被分散在所述基质中。23.根据权利要求22的生物过程指示物，其中所述激酶是三腺苷酸激酶或单腺苷酸激 酶。24.根据权利要求23的生物过程指示物，其中所述激酶是三腺苷酸激酶。25.根据权利要求23的生物过程指示物，其中所述激酶是硫化叶菌各种三腺苷酸激酶或Thermotoga sp.单腺苷酸激酶。26.根据权利要求22的生物过程指示物，其中所述激酶是来自下列的腺苷酸激酶 酸热脂环酸芽孢杆菌、A. fulgidus、敏捷气热菌、嗜火产液菌、B. caldotenax BT1、杆菌属种PS3、嗜热脂肪芽孢杆菌11057、嗜热脂肪芽孢杆菌12001、B. thermocatenulatus、 C. stercocorarium>禾中、M. ruber> P. ￡ibyssi、i^^|f!ii求胃、P. horikoshii、$ft 热球菌、R. marinus、嗜酸热硫化叶菌、芝田硫化叶菌、S. solfataricus、产乙醇热厌氧杆菌、 T. thermosulfurogenes>T. celere、T. litoralis、7jC生栖热菌 ΥΤ1、Τ· caldophilus GK24、嗜热栖热菌 HB8、T. maritima 或 T. neapolitana。27.根据权利要求22-26中任一项的生物过程指示物，其中所述热稳定激酶的所述激酶活性被限定为在所述热稳定激酶暴露于70°C 30分钟的起始步骤后残余的激酶活性。28.根据权利要求27的生物过程指示物，所述在所述热稳定激酶暴露于70°C30分钟后，所述热稳定激酶保留至少500，000相对光单位/mg激酶的激酶活性，是在萤光素/萤光素酶存在的情况下，通过发光计测定的。29.根据权利要求22-28中任一项的生物过程指示物，其中所述激酶催化由含ADP底物形成ATP。30.根据权利要求22-28中任一项的生物过程指示物，其中所述固体支持物是基质，所述激酶被分散在所述基质中。31.根据权利要求30的生物过程指示物，其中所述支持物包括聚合物基质。32.根据权利要求22-29中任一项的生物过程指示物，其中所述支持物是指示条、蘸棒或珠子。33.根据权利要求22-32中任一项的生物过程指示物，还包括稳定所述激酶的试剂。34.根据权利要求33的生物过程指示物，其中所述稳定剂选自金属离子、糖、糖醇和凝胶-形成剂。35.根据权利要求22-34中任一项的生物过程指示物，还包括将所述指示物连接于表面的手段。36.用于确认降低样品中生物因子的量或活性的处理过程的试剂盒，包括(i)根据权利要求21-35中任一项的生物过程指示物；和( )所述激酶的底物。37.根据权利要求36的试剂...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·M·萨顿，N·D·H·雷文，
申请(专利权)人：健康保护机构，
类型：发明
国别省市：GB