本发明专利技术提供了一种4-1BBL蛋白的制备方法，所述方法是采用小鼠4-1BBL(TNFSF9，NP_033430.1)胞外段蛋白的cDNA以基因工程方法制备含206个氨基酸残基(Arg?104-Glu?309)的重组4-1BBL蛋白。采用本发明专利技术方法，可大量获得4-1BBL蛋白，大大提高了蛋白得率，获得的4-1BBL胞外段蛋白可以应用于制备对4-1BBL蛋白定量的临床前研究试剂盒或药用，应用前景广阔。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种4-1BBL蛋白的制备方法。
技术介绍
4-1BB/4-1BBL是Q^8/B7之外的另一对重要的协同刺激信号分子。4-1BB (CD137) 属肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族，主要分布在活化的T细胞、NK细胞和DC细胞等表面， 其配体4-1BBL (⑶137L)主要表达在专职APC细胞(如单核巨噬细胞、DC细胞、B细胞)、活化的T细胞及一些肿瘤细胞上。4-1BBL是II型跨膜糖蛋白，分子量为34KD，人和小鼠有 36%的同源性。4-1BB/4-1BBL信号对增强和维持免疫应答有重要作用。与信号传导通路比较，4-1BB/4-1BBL主要在免疫应答的后期，为⑶8+T细胞克隆扩增、存活和记忆性杀伤提供信号，其刺激T细胞增殖和分泌细胞因子的作用在缺乏强大的CD^/B7信号时表现更明显。4-1BB的激活对⑶4+和⑶8+T细胞均有作用，但优先刺激⑶8+T细胞的活化。除了通过 4-1BB受体刺激T细胞外，4-1BBL也通过其反向信号传导通路刺激单核细胞，导致M-CSF表达及释放多种细胞因子，延长单核细胞存活期，促进细胞增殖和有丝分裂。近年，4-1BB/4-1BBL信号传导通路已成为肿瘤免疫治疗设计的一个新靶点。体内实验表明，4-1BB单抗能预防活化诱导的细胞死亡(AICD)，促进荷瘤宿主中淋巴细胞的增殖，并选择性促进I型细胞因子分泌，增强效应细胞的抗肿瘤作用。这种抗肿瘤作用对肿瘤的再次攻击有记忆性，证实有长期的抗肿瘤免疫反应存在。此外，转染4-1BBL的肿瘤细胞接种小鼠后无肿瘤生长，并存在抵御肿瘤再次攻击的免疫力。研究还发现，融合蛋白 Ig-4-lBBL与抗-4-1BB抗体一样能有效诱导肿瘤持续的特异性CTLs，治疗小鼠肝结肠癌。另一方面，在治疗性疫苗的研究中证实，表达4-1BBL的重组痘病毒明显增强HIV 疫苗诱导小鼠产生以IFN-Y应答为特征的特异性CD8+T细胞应答，这种作用在免疫后2个月仍能检测到。在CEA-转基因小鼠模型中，4-1BBL重组痘病毒明显增强表达B7. 1和CEA 的重组痘病毒疫苗的治疗作用，该作用与CEA特异性CD4+和CD8+T细胞应答水平增高相关。 最近有报道，以包括4-1BBL在内的几种共刺激分子作为DNA疫苗的分子佐剂能诱导强大的细胞应答和回忆反应。以上结果均展示了 4-1BBL在人类肿瘤和感染性疾病免疫治疗中的应用前景。现有技术对4-1BBL蛋白的制备方法是直接从组织细胞提取，得率低、成本高。不能大量应用于体内试验或临床。
技术实现思路
为了提高4-1BBL蛋白的得率，降低成本，为制备临床前试验用药或诊断试剂提供大量的原材料，本专利技术提供了一种采用4_1BBL(TNFSF9，NP_033430. 1)胞外段蛋白的cDNA 以基因工程方法制备含206个氨基酸残基(Arg 104-Glu 309)的重组4-1BBL蛋白的方法。本专利技术采用的技术方案是3一种4-1BBL蛋白的制备方法，所述方法包括(1)取含4-1BBL蛋白的小鼠淋巴细胞，conA体外刺激培养后经trizol裂解,抽提得到mRNA ；所用原料为常规含4-1BBL蛋白的小鼠淋巴细胞； (2)将mRNA逆转录得到4-1BBL胞外段蛋白的cDNA ； (3)对步骤⑵所得cDNA进行PCR扩增，得到4-1BBL蛋白目的基因；PCR扩增引物为上游引物5，-CTC GAG AAA AGA AGAACC GAG CCA AGA CCT-3，，下游引物5，-GAA TTC TTC CCATGG ATT ATC AGG-3'；(4)将步骤(3) PCR产物用Xho I和EcoR I双酶切后定向插入经同样双酶切的 ppic9，获得重组质粒 ppic9-4-lBBL ；(5)将重组质粒ppic9-4-lBBL转化至大肠杆菌DH5 α，经培养扩增、抽提纯化、测序分析，获得测序正确的重组质粒；(6)将测序正确的重组质粒转化至甲醇酵母菌，诱导表达重组蛋白；(7)将表达重组蛋白的活化菌株进行诱导发酵培养，发酵液离心，取上清液分离纯化，得到纯化的4-1BBL重组蛋白。步骤(5)重组质粒ppic9-4-lBBL的核苷酸序列如下CTC GAG AAAAGA AGA ACC GAG CCA AGA CCT GCA TTG ACC ATT ACT ACT TCTCCA AAC TTG GGT ACA AGA GAA MC AAC GCT GAC CAG GTCACT CCA GTT TCT CAC ATC GGA TGT CCA MC ACC ACC CAG CAGGGA TCT CCT GTT TTT GCT MG TTG TTG GCC AAA AAC CAG GCTTCT TTG TGT AAC ACT ACC TTG AAC TGG CAC TCT CAA GAC GGTGCC GGT TCT TCT TAC TTG TCT CAG GGT TTG AGA TAC GAG GAGGAC AAG AAG GAG TTG GTC GTC GAC TCT CCT GGA TTG TAC TACGTC TTT TTG GAG TTG AAG TTG TCT CCA ACA TTC ACC AAC ACTGGA CAC AAG GTT CAG GGA TGG GTT TCT TTG GTT TTG CAG GCTAAG CCA CAG GTT GAC GAT TTC GAC AAT TTG GCC TTG ACT GTCGAA TTG TTC CCT TGC TCT ATG GAA AAC AM TTG GTC GAC AGATCT TGG TCT CAA TTG TTG TTG TTG AAG GCC GGA CAC AGA TTGTCT GTC GGA TTG AGA GCA TAC TTG CAT GGT GCA CAA GAC GCTTAC AGA GAC TGG GAG TTG TCT TAC CCT AAC ACC ACT TCT TTCGGT TTG TTC TTG GTT AAA CCT GAT AAT CCA TGG GAA GAA TTC。所制得重组蛋白的氨基酸序列如下RTEPRPALTITTSPNLGTRENNADQVTPVSHIGCPNTTQQGSPVFAKLLAKNQASLCNTTLNWHSQDGA GSSYLSQGLRYEEDKKELVVDSPGLYYVFLELKLSPTFTNTGHKVQGWVSLVLQAKPQVDDFDNLALTVELFPCSME NKLVDRSWSQLLLLKAGHRLSVGLRAYLHGAQDAYRDWELSYPNTTSFGLFLVKPDNPWE。应用本专利技术方法获得的4-1BBL蛋白，是一个具有高灵敏度、高特异性的新指标， 运用该专利技术技术获得的4-1BBL蛋白免疫动物制备抗体，可以制成诊断试剂盒，用于对上述免疫相关疾病动物模型的发病机制、诊断、鉴别诊断及预后与疗效的观察。运用本专利技术制成成品的4-1BBL蛋白可用于临床药物的前期制备和研究，如疫苗的佐剂应用和疗效。以上具体应用方式对本领域普通技术人员来说属于公知常识，因此不再赘述。本专利技术的有益效果主要体现在采用本专利技术方法，可大量获得4-1本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种４－１ＢＢＬ蛋白的制备方法，所述方法包括：（１）取含４－１ＢＢＬ蛋白的小鼠淋巴细胞，ｃｏｎＡ体外刺激培养后经ｔｒｉｚｏｌ裂解，抽提得到ｍＲＮＡ；（２）将ｍＲＮＡ逆转录得到４－１ＢＢＬ胞外段蛋白的ｃＤＮＡ；（３）对步骤（２）所得ｃＤＮＡ进行ＰＣＲ扩增，得到４－１ＢＢＬ蛋白目的基因；ＰＣＲ扩增引物为：上游引物：５’－ＣＴＣ ＧＡＧ ＡＡＡ ＡＧＡ ＡＧＡＡＣＣ ＧＡＧ ＣＣＡＡＧＡ ＣＣＴ－３’，下游引物：５’－ＧＡＡ ＴＴＣ ＴＴＣ ＣＣＡＴＧＧ ＡＴＴ ＡＴＣ ＡＧＧ－３’；（４）将步骤（３）ＰＣＲ产物用Ｘｈｏ Ｉ和ＥｃｏＲ Ｉ双酶切后定向插入经同样双酶切的ｐｐｉｃ９，获得重组质粒ｐｐｉｃ９－４－１ＢＢＬ；（５）将重组质粒ｐｐｉｃ９－４－１ＢＢＬ转化至大肠杆菌ＤＨ５α，经培养扩增、抽提纯化、测序分析，获得测序正确的重组质粒；（６）将测序正确的重组质粒转化至甲醇酵母菌，诱导表达重组蛋白；（７）将表达重组蛋白的活化菌株进行诱导发酵培养，发酵液离心，取上清液分离纯化，得到纯化的４－１ＢＢＬ重组蛋白。
【技术特征摘要】
1.一种4-1BBL蛋白的制备方法，所述方法包括(1)取含4-1BBL蛋白的小鼠淋巴细胞，conA体外刺激培养后经trizol裂解，抽提得到 mRNA ；(2)将mRNA逆转录得到4-1BBL胞外段蛋白的cDNA；(3)对步骤⑵所得cDNA进行PCR扩增，得到4-1BBL蛋白目的基因；PCR扩增引物为 上游引物5，-CTC GAG AAA AGA AGAACC GAG CCAAGA CCT-3，，下游引物5，-GAA TTC TTC CCATGG ATT ATC AGG-3'；(4)将步骤(3)PCR产物用XhoI和EcoR I双酶切后定向插入经同样双酶切的ppic9， 获得重组质粒ppic9-4-lBBL ；(5)将重组质粒ppic9-4-lBBL转化至大肠杆菌DH5ci，经培养扩增、抽提纯化、测序分析，获得测序正确的重组质粒；(6)将测序正确的重组质粒转化至甲醇酵母菌，诱导表达重组蛋白；(7)将表达重组蛋白的活化菌株进行诱导发酵培养，发酵液离心，取上清液分离纯化， 得到纯化的4-1BBL重组蛋白。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(5)重组质粒ppic9-4-lBBL序列如下 CTC GAG AAA AGA AGA ACC GAG CCA AGA CCT GCATTG ACC ATT ACT ACT TCT CCA MC TTG GGT ACA AGA GAAAAC AAC GCT GAC CAG GTC ACT CCA GTT TCT CAC ATC GGATGT CCA AAC ACC AC...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄茵，
申请(专利权)人：杭州师范大学，
类型：发明
国别省市：86
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