本发明专利技术涉及一种鼠疫菌纤溶酶原激活因子Pla的单克隆抗体，该单克隆抗体由保藏号为CCTCC?NO：C201091或CCTCC?NO：C201094的杂交瘤细胞分泌。本发明专利技术同时涉及所述单克隆抗体的制备方法以及产生所述单克隆抗体的杂交瘤细胞株，还涉及含有所述单克隆抗体胶体金免疫层析试纸条及其在检测鼠疫菌和/或辅助诊断鼠疫中的应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及鼠疫菌纤溶酶原激活因子Pla的单克隆抗体，同时涉及所述单克隆抗体的制备方法以及产生所述单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所述单克隆抗体在检测Pla中的应用、以及含有所述单克隆抗体的胶体金免疫层析试纸条及其在检测鼠疫菌和/或辅助诊断鼠疫中的应用。
技术介绍
鼠疫(Plague)是由耶尔森氏鼠疫杆菌(Yersinia pestis)引起的自然疫源性烈性传染病。鼠疫免疫检测是鼠疫防治工作中的一个重要环节，其在鼠疫的发现、疫区处理及临床诊断中发挥至关重要的作用。传统的鼠疫免疫检测，主线是针对F1抗原。F1抗原是由耶尔森氏鼠疫杆菌pMTl质粒上cafl基因编码的一种荚膜蛋白。长期以来，F1抗原被认为是鼠疫杆菌的特异性抗原，基于F1的抗原、抗体检测方法被认为是较可信的鼠疫检测和诊断方法。然而，自然界已发现存在天然缺失F1抗原的鼠疫菌株，加之，F1抗原是一种温度调控表达抗原，在37℃时大量表达，而在28℃时不予表达或微量表达，这也限制了它的应用研究范围。发展除F1抗原外的检测和诊断技术较为必要，是鼠疫防治工作中的一个重要课题。鼠疫菌纤溶酶原激活因子(Plasminogen activator，Pla)是鼠疫菌特有的pPCPl质粒编码的细胞表面蛋白酶，研究表明，鼠疫菌纤溶酶原激活因子Pla蛋白是鼠疫菌从皮下感染扩散到循环系统的重要毒力因子(Sodeinde OA，Subrahmanyam YV，Stark K，et a1.A surface protease and the invasive character of plague[J]Science，1992，258(6)：1004-1007；Goguen JD，Hoe NP，Subrahmanyam YVBK.Proteases and bacterial virulence：a view fromthe trenches[J].Infect Agents Dis，1995，4(1)：47-54)，在鼠疫菌致病过程中发挥重要作用。且Pla的转录、翻译不受温度限制。针对Pla蛋白进行检测，对于鼠疫菌的检测和/或辅助诊断鼠疫，特别是对于F1抗原缺失鼠疫菌株以及非37℃条件生长的鼠疫菌株(特别是鼠疫的传播媒介蚤的检测)具有重要意义。目前对鼠疫菌Pla的检测主要是采用PCR技术，并取得了较好的检出效果。然而，该方法对技术操作要求比较高，且检测过程需要数小时，时间较长。另一方面，单克隆抗体相较于多克隆抗体，具有特异性强、敏感性高的优点，可作为相关抗原的生物学功能研究的重要工具，用于Western blot、免疫沉淀、免疫细胞化学等实验，对于抗原的研究、相关疾病的检测、诊断、预后判断等具有重要意义。但目前未见国内有关于鼠疫菌纤溶酶原激活因子Pla的单克隆抗体的报道。
技术实现思路
本专利技术的一个目的在于提供鼠疫菌纤溶酶原激活因子Pla的单克隆抗体，该单克隆抗体对鼠疫菌纤溶酶原激活因子Pla蛋白有特异性。本专利技术的另一个目的在于提供产生所述单克隆抗体的杂交瘤细胞株。-->本专利技术的另一个目的在于提供制备所述单克隆抗体的方法。本专利技术的另一个目的在于提供所述单克隆抗体在检测Pla蛋白中的应用。本专利技术的另一个目的在于提供一种检测Pla蛋白的胶体金免疫层析试纸条，它具有检测鼠疫菌和/或辅助诊断鼠疫作用。该胶体金免疫层析试纸条上含有本专利技术所述的单克隆抗体。本专利技术应用杂交瘤技术制备了鼠疫菌纤溶酶原激活因子Pla的单克隆抗体。首先，本专利技术的一个方面是提供了一种对鼠疫菌纤溶酶原激活因子Pla蛋白有特异性的单克隆抗体。本专利技术中所述的“抗体的特异性”是指单克隆抗体对相应抗原或近似抗原物质的识别能力。特异性高，识别抗原的能力就强。在本专利技术的一个具体实施方案中，本专利技术的单克隆抗体对GST(谷胱苷肽转移酶)-Pla融合蛋白、天然Pla蛋白有特异性，对谷胱苷肽转移酶没有特异性。在本专利技术的一个优选的具体实施方案中，所述的单克隆抗体是由保藏号为CCTCC NO.C201091或CCTCC NO.C201094的杂交瘤细胞株分泌产生。抗体类型分别属于IgG1和IgG2a。本专利技术的另一个方面提供了产生所述单克隆抗体的杂交瘤细胞株。按照《国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约》的规定，产生本专利技术单克隆抗体的两株杂交瘤细胞株已保藏在国际保藏单位之一——中国典型培养物保藏中心(China Center for Type Culture Collection，CCTCC，地址：中国武汉市武汉大学，邮政编码：430072)，保藏日期：2010年9月16日，保藏编号：CCTCC NO.C201091、CCTCC NO.C201094。本专利技术的另一个方面提供了一种制备所述单克隆抗体的方法。在本专利技术的实施方案中，是将Pla蛋白与已知的标签形成重组蛋白作为抗原，以制备获得本专利技术的单克隆抗体。所述的标签选自谷胱苷肽-S-转移酶标签(GST标签)，在本专利技术的一个具体实施方案中，采用GST与去除信号肽的Pla蛋白形成的重组蛋白。制备本专利技术的单克隆抗体所用的抗原可以按本领域技术人员已知的常规方法制备。例如本专利技术Pla蛋白可以是重组蛋白，或从鼠疫菌中提取并纯化得到的天然Pla蛋白。在本专利技术的一个优选的具体实施方案中，以GST-Pla融合蛋白作为抗原免疫小鼠，取小鼠的脾细胞作为能够产生抗体的浆细胞(免疫细胞)，与同系动物的骨髓瘤细胞进行融合。筛选能够产生目的抗体的杂交瘤细胞，进行克隆化培养，并建立杂交细胞株。上述方法仅是示例性的，例如可以用同样的方法免疫其他哺乳动物，将其脾细胞作为免疫细胞。还可以选择适宜的骨髓瘤细胞用于融合，例如用来自大鼠、小鼠或仓鼠的骨髓瘤细胞。免疫细胞与骨髓瘤细胞的融合可以按照常规方法进行(Milstein et al.，Mechods Enzymol.，1981，73，3-46)。更具体地说，免疫细胞和骨髓瘤细胞可以按照1∶4～1∶10的比例在培养基中充分混合，在融合促进剂的作用下进行细胞融合，例如将预热至37℃的PEG(分子量1000～6000)溶液以30％～60％(W/V)的比例加入培养基。此外，还可以根据需要适当加入佐剂(如二甲基亚砜)以增强融合效果。用于融合的培养基包括RPMI-1640培养基、DMEM培养基以及其他可用于此类培养的培养基，并根据需要补加适量的新生小牛血清等物质。可以用普通的选择培养基筛选杂交瘤细胞，例如用含有次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶核苷的HAT培养基。在HAT培养基中持续培养足够的时间，以使杂交瘤以外的细胞(非融合细胞)死亡，一般为几天至几周。-->然后筛选产生目的抗体的杂交瘤细胞并进行单克隆化。得到的产生本专利技术单克隆抗体的杂交瘤细胞，可以在普通培养基中传代培养或者在液氮中长时间保存。从杂交瘤细胞制备本专利技术的单克隆抗体时，可以从杂交瘤细胞体外培养上清液中获得抗体，或者将杂交瘤细胞注入适宜的哺乳动物并从动物腹水中获取抗体。前一种方法适于获得高纯度的抗体，后一种方法适于获取大量、高效价抗体。通过上述方法获得的抗体，可以用常规方法纯化，例如盐析、凝胶过滤、亲和色谱等方法。在本专利技术的一具体实施方案中，所述制备单克隆抗体的方法包括用GST-Pla融合蛋白免疫小鼠，取小鼠的脾细胞本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种对鼠疫菌纤溶酶原激活因子Ｐｌａ蛋白有特异性的单克隆抗体，该单克隆抗体由保藏号为ＣＣＴＣＣ ＮＯ：Ｃ２０１０９１或ＣＣＴＣＣ ＮＯ：Ｃ２０１０９４的杂交瘤细胞分泌。
【技术特征摘要】
1.一种对鼠疫菌纤溶酶原激活因子Pla蛋白有特异性的单克隆抗体，该单克隆抗体由保藏号为CCTCC NO：C201091或CCTCC NO：C201094的杂交瘤细胞分泌。2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，该抗体对天然Pla蛋白有特异性，对谷胱苷肽转移酶没有特异性。3.分泌权利要求1所述的单克隆抗体的杂交瘤细胞系，其保藏号为CCTCC NO.C201091或CCTCC NO.C201094。4.一种制备权利要求1所述的单克隆抗体的方法，该方法包括用GST-Pla融合蛋白免疫小鼠，取小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合，筛选出能够分泌对天然Pla蛋白有反应性、对谷胱苷肽转移酶没有反应性的单克隆抗体的杂交瘤细胞，从杂交瘤细胞上清液中或从注射杂交瘤细胞后的动物腹水中获取单克隆抗体。5.由保藏号为CCTCC NO：C201091和/或CCTCC NO：C201094的杂交瘤细...
【专利技术属性】
技术研发人员：杜春红，宋志忠，张建中，王鹏，唐雪，郭英，尹家祥，
申请(专利权)人：云南省地方病防治所，
类型：发明
国别省市：53
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