一种呼吸道归巢siRNA雾化纳米给药系统及其制备方法技术方案

本发明专利技术公开了一种呼吸道归巢siRNA雾化纳米给药系统，该给药系统以经超声雾化处理后的沙丁胺醇胍基化壳聚糖为载体材料，包裹干扰目标致病基因的siRNA制成。本发明专利技术还公开了上述呼吸道归巢siRNA雾化纳米给药系统的制备方法。本发明专利技术公开的给药系统可用于运送干扰目标致病基因的siRNA，以发挥RNA干扰作用，抑制致病基因复制，能够在活体内运送siRNA靶向肺呼吸道上皮，是以沉默靶基因为目的发挥相应药效作用的非病毒运送系统。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种给药系统，尤其是涉及一种呼吸道归巢siRNA雾化纳米给药系统。本专利技术同时还涉及上述呼吸道归巢siRNA雾化纳米给药系统的制备方法。
技术介绍
RNA干扰(interfering RNAs，RNAi)是基因治疗研究最具应用前景的一个领域。就生物普遍规律而言，RNAi可使任何一种基因沉默，同时，由于RNAi介导基因沉默的高特异、高效和简易性，在一些由病原体入侵如病毒感染或基因突变引起的疾病治疗方面具有显见的临床应用前景。已有研究表明，用SARS冠状病毒某些结构蛋白基因的siRNA，可抑制感染SARS冠状病毒恒河猴肺内的病毒复制。另外，利用siRNA特异地抑制癌基因、癌相关基因或突变基因的过度表达，使这些基因保持在静寂或休眠状态，有望达到抗肿瘤作用。RNA干扰也能应用于气道炎症性疾病的治疗，Shao等研究表明，用siRNA特异性抑制人气道上皮胞NCI-H292中的TGFα可以导致GFR表达的降低并减少气道上皮黏液的分泌(ShaoMX，NakanagaT，NadelJA.Cigarette smoke induces MUC5ACmucin overproduction via tumor necrosis factor-α-converting enzyme in human airwayepithelial(NCI-H292)cells.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2004，287(2)：L420-L427)。然而，siRNA在体内易被核酸酶降解，因而它的稳定性差、且半衰期短、缺乏靶向性，需要结合载体系统进行基因的递送。目前常用的基因递送方法主要分为两类，即病毒载体和非病毒载体导入技术，其中，病毒载体转染效率高，是目前体内基因治疗的主要工具。然而，尽管病毒载体具有很高的转染效率，但其存在免疫原性和潜在致瘤性等安全性隐患。非病毒载体主要有脂质体、阳离子高聚物等，但非病毒基因载体因缺少病毒载体天然的基因递送机制，转染效率低下，极大地限制了其实际应用。因此，如何将siRNA安全有效运送到病变靶器官，进入靶细胞充分有效发挥RNA干扰作用，成为目前临床应用siRNA治疗的瓶颈问题。壳聚糖是近年来发展起来的一种新型非病毒基因转运载体，也是唯一的一种天然阳离子多糖。它具有良好的生物相容性，生物可降解性，安全性好。然而，同其他非病毒载体一样，壳聚糖自身跨越细胞膜屏障能力较低，需要对其进行修饰，以提高其跨膜能力。细胞穿膜肽(cell penetrating peptide，CPP)是一类能携带大分子物质进入细胞，具有穿膜能力的短肽。Wender等发现，精氨酸在细胞穿膜肽的跨膜中起到关键的作用，其特征基团胍基是促进跨膜的核心因素(Wender P.A，Mitchell D.J，Pattabiraman K，et al.Thedesign，synthesis，and evaluation of molecules that enable or enhance cellular uptake：peptoid moleculartransporters，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2000，97：13000-13008)。本专利技术专利技术人前期已成功合成了胍基化壳聚糖，且证实该修饰方法能明显提高天然壳聚糖体外细胞转染DNA核酸的能力。胍基修饰简单无毒，经胍基修饰后的壳聚糖生理PH环境下能充分溶解。为了进一步提高胍基化壳聚糖向细胞转运核酸物质的能力，依据配体与受体相结合的原理，专利技术人的中国专利申请CN 101781373A中公开了一种沙丁胺醇接枝胍基化壳聚-->糖及其制备方法，是将临床药用β2肾上腺受体激动剂沙丁胺醇(气道解痉抗炎制剂)接枝到胍基化壳聚糖分子上构成沙丁胺醇接枝胍基化壳聚糖，并通过体外细胞研究证实该载体能够进一步提高细胞的基因转染效率。但是由于人体或动物体内环境复杂，因此仅在体外直接转染培养的细胞证明该载体有较好的基因转染效率，并不意味着体内应用的可行性。载体粒径是基因微粒分散递送系统的重要参数，它的大小与物理特点除了会影响载体微粒在靶细胞表面的吸附和摄取以外，还会影响在细胞内复合物从内涵体成功逃逸、核酸物质的释放等过程。而纳米粒径的均匀度是纳米载体的另一个重要参数，粒径的分布宽，表示在任一局部范围内分布的纳米粒均较少，所以无论最适粒径是多少，即使该纳米载体的最适转染粒径接近平均粒径，但因在平均粒径附近的纳米粒的比例小，大部分颗粒的粒径远离平均粒径，或者太大，或者太少，所以能有效对基因进行转染的载体比例并不多。从图9的a中可见，先前的沙丁胺醇胍基化壳聚糖(Sal-胍基化壳聚糖)的粒径大小分布不均匀，且Sal-胍基化壳聚糖与核酸物质复合后的粒径较小，约在20～60nm范围之间，粒径分布离散度大，说明有利于细胞转染的最适合粒径Sal-胍基化壳聚糖纳米粒的比例少(图10)。而如何实现壳聚糖纳米载体体内运送核酸物质导入目标器官组织和细胞，是siRNA介导基因沉默临床应用需要解决的关键科学问题。采用吸入给药方式是治疗呼吸道疾病的临床有效的给药方式，可以实现靶向目标器官。但吸入药气雾的颗粒大小只有在4～6um之间，才能使药物雾滴在肺内沉积从而发挥药效。相对于临床其它吸入方式，超声雾化吸入更加简单易行。该吸入方式通过采纳一个超声雾化装置将水溶性药液在高频振荡的作用下，形成由4～6um超微粒子构成的气雾吸入治疗。但问题是高频振荡会对核酸物质的结构造成破坏，因此在临床难以采纳吸入治疗模式进行呼吸系统疾病小分子RNA干扰治疗。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的在于通过提供一种呼吸道归巢siRNA雾化纳米给药系统，该给药系统可用于运送干扰目标致病基因的siRNA，以发挥RNA干扰作用，抑制致病基因复制，能够在活体内运送小分子RNA(siRNA)靶向肺呼吸道上皮，是以沉默靶基因为目的发挥相应药效作用的非病毒运送系统。本专利技术的第二个目的是提供上述呼吸道归巢siRNA雾化纳米给药系统的制备方法。本专利技术的第一个目的是通过以下技术方案来实现的：一种呼吸道归巢siRNA雾化纳米给药系统，该给药系统以经超声雾化处理后的沙丁胺醇胍基化壳聚糖为载体材料，包裹干扰目标致病基因的siRNA制成。沙丁胺醇胍基化壳聚糖(Sal-胍基化壳聚糖)中具有β2肾上腺能受体配体沙丁胺醇，即具有了归巢装置，对于呼吸道上皮细胞，平滑肌细胞及肥大细胞等具有靶向效果。而在超声雾化处理前，Sal-胍基化壳聚糖的粒径较小，粒径分布离散度大，粒径大小及分布都很不理想，且最适粒径Sal-胍基化壳聚糖纳米粒的比例少，致使人体内靶器官的细胞的摄取量少，难以发挥有效的RNA干扰作用。经过本专利技术人的研究发现无论是单独的Sal-胍基化壳聚糖纳米粒还是Sal-胍基化壳聚糖与核酸物质复合纳米粒，经过超声雾化处理后，-->其粒径都会出现相应的增大。经超声雾化物理修饰后的Sal-胍基化壳聚糖纳米粒的粒径较超声雾化前大，粒径分布离散度小，且最适粒径Sal-胍基化壳聚糖纳米粒的比例多。经实验证明，siRNA与经超声雾化处理后的Sal-胍基化壳聚糖纳米载体复合，形成在体内可被靶器官细胞高效摄取的结构形式(具体讲就是能在体内特异地被肺内气本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种呼吸道归巢ｓｉＲＮＡ雾化纳米给药系统，其特征在于，该给药系统以经超声雾化处理后的沙丁胺醇胍基化壳聚糖为载体材料，包裹干扰目标致病基因的ｓｉＲＮＡ制成。

【技术特征摘要】
1.一种呼吸道归巢siRNA雾化纳米给药系统，其特征在于，该给药系统以经超声雾化处理后的沙丁胺醇胍基化壳聚糖为载体材料，包裹干扰目标致病基因的siRNA制成。2.根据权利要求1所述的呼吸道归巢siRNA雾化纳米给药系统，其特征在于，所述的呼吸道归巢siRNA雾化纳米给药系统的粒径在65～85nm范围之间。3.根据权利要求1所述的呼吸道归巢siRNA雾化纳米给药系统，其特征在于，所述的沙丁胺醇胍基化壳聚糖和干扰目标致病基因的siRNA之间的质量比为1～5∶1。4.一种权利要求1～3任一权利要求所述的呼吸道归巢siRNA雾化纳米给药系统的制备方法，其特征在于，其包括以下步骤：(I)取沙丁胺醇胍基化壳聚糖加水溶解，配制得到沙丁胺醇胍基化壳聚糖水溶液，然后加入干扰目标致病基因的siRNA混合复合，沙丁胺醇胍基化壳聚糖包裹干扰目标致病基因的siRNA形成沙丁胺醇胍基化壳聚糖与干扰目标致病基因的siRNA的复合物溶液；(II)将所述的沙丁胺醇胍基化壳聚糖与干扰目标致病基因的siRNA的复合物溶液置于超声雾化装置中，进行雾化成雾滴，得到沙丁胺醇胍基化壳聚糖与干扰目标致病基因的siRNA复合雾化纳米粒，即本发明的给药系统。5.根据权利要求4所述的呼吸道归巢siRNA雾化纳米给药...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐军，罗永峰，刘文广，翟欣昀，孙鹏，
申请(专利权)人：广州医学院，呼吸疾病国家重点实验室，天津大学，
类型：发明
国别省市：81