本发明专利技术属于微生物发酵和生物分离领域，公开了一株联产LI-F类抗生素和邻苯二甲酸二丁酯的多粘类芽孢杆菌菌株及其应用。该菌株为多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)JSa-9，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC?No.4314。该菌株能联产LI-F类抗生素和邻苯二甲酸二丁酯，可用于制备抗生素，可开发成为新型的天然食品防腐剂及生防试剂，广泛应用于水果和蔬菜等食品加工和防腐保鲜，对于延长食品保质期和减少农作物病虫害等具有十分重要的价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于微生物发酵和生物分离领域，涉及一种联产LI-F类抗生素(即LI-F抗菌脂肽，目前无中文名称，总共包括12种组分，其中分子量883、897、947、961四种也可以叫Furscidins即杀镰孢菌素)和邻苯二甲酸二丁酯的多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)菌株。利用多粘类芽孢杆菌生产的LI-F类抗生素适用于生物防治、食品加工和农产品贮藏保鲜等。
技术介绍
食品发酵工业、农业生产以及医药工业长期面临以下一些问题：食品的微生物污染，植物病虫害，日益严重的致病菌抗药性。传统的解决方法(化学防腐剂、化学农药、抗生素)虽然可以暂时缓解矛盾，然而随着检测技术的进步以及环保意识的提高，人们开始注意到上述化学药剂的潜在危害。开发高效、安全无毒、性能稳定、广谱的天然防腐剂已经成为当前食品、医药、植物抗病基因工程领域的研究和应用热点，将具有更广阔的发展空间。基于科技的进步，检测手段的完善以及人类对生态环境意识的提高，低毒、高效、选择性强、残留时间短、对环境污染小的微生物天然防腐剂和生防试剂的研究和开发日益引起国内外专家学者的关注。微生物是地球上分布最为广泛的一大类生物，它无处不在，是一个丰富的资源宝库。细菌又作为自然界中分布最广泛的一类微生物，以其繁殖速度快、适应能力强、易于人工培养等优势，倍受微生物工作者越来越多的关注。从微生物中提取抗菌物质成本低、周期短、操作简单方便、容易实现工业化生产，而且微生物分泌的抗菌物质抑菌谱较宽，热稳定性较好，适用pH范围广，使用过程不易产生抗性菌和交叉拈抗性，因此可以发挥更大的工业应用价值。多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)是一种产芽孢的革兰氏阳性细菌，原名多粘芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)，以形态学为分类基础，早期研究将其归入芽孢杆菌属。多粘类芽孢杆菌细胞呈杆状，革兰氏染色阳性、阴性或可变，接触酶阳性，氧化酶反应可变，厌氧条件下所测定的大多数菌株固定氮。多粘类芽孢杆菌是少数能够产生具有临床应用价值的抗生素的细菌之一，由它产生的多粘菌素B(polymyxins B，PMB)和多粘菌素E(colistin)已在临床上用于抗细菌感染。其中的某些菌株也是重要的植物生防细菌和植物根际促生菌(plant growth promoting rhizobacteria，PGPR)，并且在农业领域已得到广泛的应用。此外，多粘类芽孢杆菌及其代谢产物在工矿业及废水处理方面也有应用。由于其诱人的应用前景，美国环保署(EPA)将它列为可商业上应用的微生物之一，我国农业部也将其列为免做安全鉴定的一级菌种。研究表明，多粘类芽孢杆菌能产生多种抗菌物质，其中包括肽类、蛋白质类、核苷类、吡嗪类和酚类等，能够防治多种植物病害。多粘类芽孢杆菌的不同菌株之间可能产生同种的抗菌物质，而同一菌株也可能同时产生多种不同抗菌物质。多粘类芽孢杆菌在生物防治、食品加工和农产品贮藏保鲜等方面非常具有应用潜力，但是要实现商业化，还必须加强-->高产菌株的选育、培养基和培养条件优化、制剂研制等方面的研究。
技术实现思路
本专利技术目的是针对上述技术问题提供一种联产LI-F类抗生素和邻苯二甲酸二丁酯的Paenibacillus polymyxa菌株以及该菌株的用途。本专利技术另一个目的是提供利用上述菌株进行LI-F类抗菌脂肽和邻苯二甲酸二丁酯的微生物发酵和分离鉴定方法。本专利技术的目的通过下列技术方案实现：一株联产LI-F类抗生素和邻苯二甲酸二丁酯的多粘类芽孢杆菌菌株，该菌株为多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)JSa-9，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No.4314。所述的多粘类芽孢杆菌菌株在制备抗生素方面的应用，特别是该菌株在联产LI-F类抗生素和邻苯二甲酸二丁酯方面的应用。利用CGMCC No.4314菌株进行LI-F类抗生素和邻苯二甲酸二丁酯的微生物发酵和分离鉴定方法，包括下列步骤：a.将保藏号为CGMCC No.4314的多粘类芽孢杆菌JSa-9进行培养，得到抗菌物质发酵液；b.抗菌物质发酵液离心，收集上清液，萃取，将有机相进行纳滤，得抗菌提取物；c.抗菌提取物通过HPLC分离纯化LI-F类抗生素及邻苯二甲酸二丁酯；d.对分离纯化的物质进行鉴定。进一步，所述的方法包括下列步骤：a.多粘类芽孢杆菌JSa-9产LI-F类抗生素和邻苯二甲酸二丁酯的发酵将多粘类芽孢杆菌JSa-9接种于试管斜面营养琼脂培养基上，30℃培养24h，将菌种活化；再将试管斜面活化的多粘类芽孢杆菌JSa-9菌种接种于LB液体培养基，30℃、180rpm培养20～24h，至对数生长期，制成浓度为107～108cfu/l的种子液；将多粘类芽孢杆菌JSa-9种子液以10％浓度接种于Landy发酵培养基中，在30℃和150rpm条件下培养72h，得到抗菌物质发酵液；b.多粘类芽孢杆菌JSa-9产LI-F类抗生素和邻苯二甲酸二丁酯的分离①发酵液在12.000g下离心20min除去菌体，然后用与上清液相同体积的乙酸乙酯以萃取法抽提两次后，将有机相经过1-2nm的纳滤膜，即为获得的抗菌提取物；②多粘类芽孢杆菌JSa-9产抗菌物质高效液相色谱分析(HPLC)：将多粘类芽孢杆菌JSa-9抗菌提取物采用RP-C18柱(4.6mmΦ×250mm)进行HPLC分离纯化LI-F类抗生素和邻苯二甲酸二丁酯；洗脱液为含3.8mmol三氟乙酸的水和乙腈溶液(三氟乙酸和乙腈为MERK公司产品)，梯度洗脱条件为：0～20min，乙腈10～40％；20～30min，乙腈40～60％；30～40min，乙腈60～70％；流速为0.5ml/min；检测波长为210nm；邻苯二甲酸二丁酯标准样品(美国SIGMA公司)也在相同条件下进行HPLC层析；LI-F类抗生素和邻苯二甲酸二丁酯的HPLC洗脱保留时间分别约为25～30和52min；c.多粘类芽孢杆菌JSa-9产抗菌物质的鉴定多粘类芽孢杆菌JSa-9抗菌提取物经HPLC分离后，各抗菌组分再利用电-->喷雾电离、诱导碰撞解离质谱(Electrospray ionization mass spectrometry/collision-induceddissociation，ESI-MS/CID)测定其分子量和鉴定其结构。所述的方法，其中步骤b中高效液相色谱仪为美国AGILENT 1100series，配备DVD检测器。所述的方法，其中步骤c中在质谱分析前对环脂肽样品采用弱碱性NaOH在40℃条件下处理24h水解成直链；ESI-MS/CID采用配备了电喷雾离子源的LCQDECA XPPLUS Thermo Finnigan液质联用(LS-MS)设备(Thermo Corporation，USA)，采用MS柱(2.6mmΦ×250mm，2μm)进行分析，HPLC条件中流动相成分和比例与多粘类芽孢杆菌JSa-9产抗菌物质的分离步骤相同，流速为2μl/min；电喷雾源操作电压为5kV，操作温度为300℃，操作压力为20abr。本专利技术利用多粘类芽孢杆菌生产抗菌物质，其特征为：该抗菌物质包括LI-F类抗生素和本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一株联产ＬＩ－Ｆ类抗生素和邻苯二甲酸二丁酯的多粘类芽孢杆菌菌株，该菌株为多粘类芽孢杆菌（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｌｙｍｙｘａ）ＪＳａ－９，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（ＣＧＭＣＣ），保藏号为ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．４３１４。
【技术特征摘要】
1.一株联产LI-F类抗生素和邻苯二甲酸二丁酯的多粘类芽孢杆菌菌株，该菌株为多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)JSa-9，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No.4314。2.权利要求1所述的多粘类芽孢杆菌菌株在制备抗生素方面的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于该菌株在联产LI-F类抗生素和邻苯二甲酸二丁酯方面的应用。4.利用权利要求1所述菌株进行LI-F类抗生素和邻苯二甲酸二丁酯的微生物发酵和分离鉴定方法，其特征在于包括下列步骤：a.将保藏号为CGMCC No.4314的多粘类芽孢杆菌JSa-9进行培养，得到抗菌物质发酵液；b.抗菌物质发酵液离心，收集上清液，萃取，将有机相进行纳滤，得抗菌提取物；c.抗菌提取物通过HPLC分离纯化LI-F类抗生素及邻苯二甲酸二丁酯；d.对分离纯化的物质进行鉴定。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于包括下列步骤：a.多粘类芽孢杆菌JSa-9产LI-F类抗生素和邻苯二甲酸二丁酯的发酵将多粘类芽孢杆菌JSa-9接种于试管斜面营养琼脂培养基上，30℃培养24h，将菌种活化；再将试管斜面活化的多粘类芽孢杆菌JSa-9菌种接种于LB液体培养基，30℃、180rpm培养20～24h，至对数生长期，制成浓度为107～108cfu/l的种子液；将多粘类芽孢杆菌JSa-9种子液以10％浓度接种于Landy发酵培养基中，在30℃和150rpm条件下培养72h，得到抗菌物质发酵液；b.多粘类芽孢杆菌JSa-9产LI-F类抗生素和邻苯二甲酸二丁酯的分离①发酵液在12.000g下离心20min除去菌体，然后用与上清液相同体积的乙酸乙酯以萃取法抽提两次后，将有机相经过1-2nm的纳滤膜，即为获...
【专利技术属性】
技术研发人员：别小妹，邓阳，陆兆新，吕凤霞，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：84
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