检测人西尼罗病毒IgG抗体的间接ELISA试剂盒及其检测方法技术

本发明专利技术公开一种检测人西尼罗病毒IgG抗体的间接ELISA试剂盒及其检测方法，本发明专利技术应用哺乳动物细胞表达系统表达的西尼罗病毒样颗粒为包被抗原建立了ELISA方法，由于病毒样颗粒(VLPs)是含有一个或多个病毒结构蛋白的空心颗粒，没有病毒的核酸，不能自主复制，而且具有与天然病毒同样的构象和抗原表位，因此对人不具有感染性，稳定性好，不易失活，有较高的安全性，免疫原性更接近于天然病毒。本发明专利技术为检测人西尼罗病毒IgG抗体提供一种安全，特异，敏感，快速，操作简单，经济的试剂盒，为预防和控制西尼罗病毒从国外输入我国方面提供了技术手段和方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及病毒学、分子生物学和生物制品领域，尤其是一种检测人西尼罗病毒 IgG抗体的间接ELISA试剂盒及其检测方法。
技术介绍
西尼罗病毒(West Nile Virus，WNV)为黄病毒科黄病毒属(Flavivirus)，为单股正链RNA病毒，表达的蛋白可以分为10个单独的蛋白结构3个结构蛋白，囊膜蛋白( E)、膜蛋白(M)和核衣壳蛋白(C)，以及7个非结构蛋白NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、 NS4B和NS5结构与登革病毒等黄病毒相似。西尼罗病毒感染人体以后可以引起一种称之为“西尼罗热”的急性传染病。这种病毒可以引起高热、头痛、肌肉疼痛、皮疹、淋巴结肿大等症状，可侵犯中枢神经系统，产生脑膜脑炎症状，严重者危及病人生命。目前尚无有效的治疗方法和疫苗接种，因此该病一旦暴发流行极易引起人们的恐慌，已构成全球性公共卫生的新威胁。西尼罗病毒感染的主要流行地区是非洲、北美洲、欧洲，但近年来，印度、马来西亚、泰国、菲律宾、土耳其、以色列、印度尼西亚、巴基斯坦等我国周边的国家相继出现，并有向我国传入的趋势，加强西尼罗病毒传入的监测和防范工作非常必要，尤其需要加强出入境人员、动物的感染监测以及出入境血液制品、生物制品等生物物质检测工作，并尽快调查国内动物血清学感染情况。因此，急需建立一种快速、简便的西尼罗病毒诊断方法。目前，国内建立的检测WNV抗体的方法有PCRJaciMan RT2PCR、NASBA、SYBR Green RT-PCR等核酸检测，病毒分离培养，补体结合实验，血凝抑制实验等等。上述技术和方法虽然可以检测WNV及其抗体水平，在实践中也取的一定的效果，但均存在试验操作复杂，耗时长，需要特定的专业技能和仪器设备等，常限于实验室内进行，很难普及和推广。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种检测人西尼罗病毒IgG抗体的间接ELISA试剂盒，内设置有包被西尼罗病毒样颗粒的可拆96孔酶标板，酶结合物工作液，cutoff血清，阳性对照，阴性对照，样品稀释液，洗涤液，TMB底物溶液和终止液。进一步，所述西尼罗病毒样颗粒是通过基因重组技术，以真核细胞表达系统共表达病毒衣壳的蛋白成分，通过病毒形态学和分子免疫学鉴定，蔗糖梯度离心结合超速离心纯化，获得西尼罗病毒的VLPs。进一步，所述样品稀释液为的0. 01M、pH7. 4的磷酸缓冲液；所述洗涤液为含0. 1% 吐温-20的0. 1M、pH7. 4的磷酸缓冲液，所述终止液为2M硫酸溶液。利用上述试剂盒间接ELISA诊断人西尼罗病毒的方法，具体为1)被检测血清、cutoff血清、标准阳性血清和标准阴性血清都用血清稀释液作 1:100稀释后，按酶标板加样模式每孔加入IOOul，37度放置Ih ；2)倒尽板孔中液体，加满洗涤液，静置:3min，反复三次，最后将反应板倒置在吸水纸上，使孔中洗涤液流尽；3)每反应孔加入辣根过氧化物酶羊抗人IgG使用液，每孔100ul，37度放置0. 5h， 倒尽板孔中液体，加满洗涤液，静置3min，反复三次，最后将反应板倒置在吸水纸上，使孔中洗涤液流尽；4)每个显色孔加显色底物IOOul，室温放置15min ；5)每个显色孔加终止液50ul终止反应；6)用酶标仪测定OD值在450nm波长下测定各孔吸光光。进一步，所述方法检测样本的判定标准为每板、或同一板的孔条或孔检测时，必须包括cut-off校准样和两个对照样，判定结果以待测样本OD45tl值与cutoff OD450值比值 P/C，大于等于1. 5判定为阳性，小于等于1. 3判定为阴性，介于1. 3-1. 5之间为可疑，须重检，重检时P/C值大于等于1. 5判定为阳性，小于等于1. 3判定为阴性。本专利技术应用哺乳动物细胞表达系统表达的西尼罗病毒样颗粒为包被抗原建立了 ELISA方法，由于病毒样颗粒(VLPs)是含有一个或多个病毒结构蛋白的空心颗粒，没有病毒的核酸，不能自主复制，而且具有与天然病毒同样的构象和抗原表位，因此对人不具有感染性，稳定性好，不易失活，有较高的安全性，免疫原性更接近天然病毒。本专利技术为检测人西尼罗病毒IgG抗体提供一种安全，特异，敏感，快速，操作简单，经济的试剂盒，为预防和控制西尼罗病毒从国外入我国方面提供了技术手段和方法。附图说明图1为具有完整序列的四株西尼罗病毒资料统计图2A为具有完整序列的西尼罗病毒株M氨基酸进化树比对图； 图2B为具有完整序列的西尼罗病毒株E氨基酸进化树比对图； 图2C为具有完整序的西尼罗病毒北美株与亚洲株M氨基酸进化树比对图； 图2D为具有完整序列的西尼罗病毒北美株与亚洲株E氨基酸进化树比对图； 图3A — 1为正常细胞在IOX倍下镜下图； 图3Α — 2为正常细胞在40Χ倍下镜下图； 图3Α — 3为正常细胞在100Χ倍下镜下图:3Β — 1为转染P⑶NA5-WNV-JME后的细胞在IOX倍下镜下结果图； 图:3Β — 2为转染P⑶NA5-WNV-JME后的细胞在40Χ倍下镜下结果图； 图:3Β — 3为转染P⑶NA5-WNV-JME后的细胞在100Χ倍下镜下结果图； 图4Α为SDS-PAGE结果图4Β为用西尼罗病毒E单抗(millipore)进行Wfestern印迹杂交图； 图5A为蔗糖密度梯度超速离心纯化后共表达西尼罗病毒Μ、E蛋白的真核细胞表达系统形成西尼罗病毒样颗粒电镜图； 图5B为图5A中的A部放大图； 图6为ELISA结果图。具体实施例方式如图1至图6所示，图4A为SDS-PAGE结果，泳道1为正常细胞超声破碎，离心上清，过滤、超滤管浓缩后样品；泳道2为蛋白Marker ；泳道3为共表达西尼罗病毒包膜蛋白的细胞培养上清液过滤、超滤管浓缩后样品；泳道4为共表达西尼罗病毒包膜蛋白的细胞超声破碎，离心上清，过滤、超滤管浓缩后样品。图4Β为用西尼罗病毒E单抗(mi 11 ipore)进行Wfestern印迹杂交。泳道1为共表达西尼罗病毒包膜蛋白的细胞培养上清液过滤、超滤管浓缩后样品；泳道2为共表达西尼罗病毒包膜蛋白的细胞超声破碎，离心上清，过滤、超滤管浓缩后样品；泳道3为正常细胞超声破碎，离心上清， 过滤、超滤管浓缩后样品；泳道2为蛋白Marker。图5A、5B显示蔗糖密度梯度超速离心纯化后共表达西尼罗病毒M、E蛋白的真核细胞表达系统形成西尼罗病毒样颗粒电镜照片。这些颗粒是由西尼罗病毒包膜M、E蛋白在细胞中共表达而产生于细胞胞内自动组装形成的。本专利技术一种检测人西尼罗病毒IgG抗体的间接ELISA试剂盒，采用的技术策略是 通过基因重组技术，以真核细胞表达系统共表达病毒衣壳的蛋白成分，通过病毒形态学和分子免疫学鉴定，获得西尼罗病毒的VLPs，以用于抗体检测试剂盒的组装工作以及西尼罗病毒单克隆抗体的筛选工作。在GENEBANK中检索西尼罗病毒(WNV)，挑取完整全序列病毒株，用生物软件对这完整全序列病毒株Μ、E蛋白进行氨基酸序列分析比对，筛选出典型西尼罗病毒株 NY99-crow-V76/l ；调出其目的基因片段PrMO CpreM和M)和ft~E0，分别合成，合成后克隆入pET30_a载体中.以其为模板，设计合适的引物，PCR扩增M，E片段，然后设计合适的引物，以其PCR产物为模板扩增，得到重组基因WNV-ME ；最后引本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．检测人西尼罗病毒ＩｇＧ抗体的间接ＥＬＩＳＡ试剂盒，其特征在于，该试剂盒内设置有包被西尼罗病毒样颗粒的可拆９６孔酶标板，酶结合物工作液，ｃｕｔｏｆｆ血清，阳性对照，阴性对照，样品稀释液，洗涤液，ＴＭＢ底物溶液和终止液。

【技术特征摘要】
1.检测人西尼罗病毒IgG抗体的间接ELISA试剂盒，其特征在于，该试剂盒内设置有包被西尼罗病毒样颗粒的可拆96孔酶标板，酶结合物工作液，cutoff血清，阳性对照，阴性对照，样品稀释液，洗涤液，TMB底物溶液和终止液。2.如权利要求1所述的检测人西尼罗病毒IgG抗体的间接ELISA试剂盒，其特征在于，所述西尼罗病毒样颗粒是通过基因重组技术，以真核细胞表达系统共表达病毒衣壳的蛋白成分，通过病毒形态学和分子免疫学鉴定，蔗糖梯度离心结合超速离心纯化，获得西尼罗病毒的VLPs。3.如权利要求1所述的检测人西尼罗病毒IgG抗体的间接ELISA试剂盒，其特征在于，所述样品稀释液为的0. 01M、pH7. 4的磷酸缓冲液；所述洗涤液为含0. 1%吐温-20的 0. 1Μ、ρΗ7. 4的磷酸缓冲液，所述终止液为2M硫酸溶液。4.利用上述试剂盒间接ELISA诊断人西尼罗病毒的方法，其特征在于，该方法具体为1)被检测血清、cutoff血清、标准阳性血清和标准阴性血清都用血清稀释液作 1:10...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡孔新，咸庆杰，郭雪，杨鹏飞，平芮巾，张丽萍，马雪征，
申请(专利权)人：中国检验检疫科学研究院，
类型：发明
国别省市：11