一种微流控单细胞活性氧自动分析仪制造技术

本发明专利技术提供一种微流控单细胞活性氧自动分析仪。该分析仪由系统控制模块、细胞荧光标记模块、细胞/流体电动操纵模块、细胞/流体液压操纵模块、微流控芯片与芯片操作平台、单细胞捕获“识别与触发”模块、荧光检测模块、信号处理与数据采集模块和程序软件组成。本发明专利技术将单细胞组分分析方法、细胞荧光标记、细胞/流体操纵、荧光检测、微电子控制技术集成，提出了一种单细胞捕获“识别与触发”的概念，利用单细胞到达分离通道入口时的电阻变化识别单细胞的捕获，并同时触发“单细胞捕获、溶膜”操作的自动切换和数据采集。本发明专利技术可以实现微流控芯片上细胞荧光标记、细胞上样、单细胞捕获、溶膜、电泳分离和单细胞内活性氧检测等操作。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及微流控分析平台技术，尤其涉及一种可以自动实现微流控芯片上细胞荧光标记、细胞上样、单细胞捕获、溶膜、电泳分离和胞内活性氧检测的微流控单细胞活性氧自动分析仪。
技术介绍
细胞是生物体的形态结构和生命活动的基本单元。在细胞的代谢过程中会不断产生各种活性氧(ROS)，例如超氧阴离子(Of)、过氧化氢(H2O2)、羟基自由基(0H ·)、脂自由基(R00 ·)、过氧亚硝基阴离子(0N00-)等。适当水平的活性氧对生物正常的生理过程是重要的，它们参与细胞信号转导、细胞生长调节、重要生物物质的合成及细胞代谢。当生物处于氧化胁迫、外源性药物或毒素刺激条件下，过量活性氧的产生并积累则会诱导一系列有害的细胞信号转导，导致机体产生各种疾病及老化。近几年细胞水平上活性氧的分析研究非常令人关注，但由于细胞尺度小(通常直径在μ m级、体积在pL级)、胞内活性氧含量低 (一般为amol zmol级)、生化反应快(通常在ms级)，使得目前一些分析方法多是将各种活性氧作为一个整体获得的结果多是基于静态、宏观的观察和整体平均而推导出来的。 因此，发展高选择性、高灵敏度、能同时识别和检测单个细胞内不同活性氧的仪器装置及分析方法，对于发现宏观检测所不能获得的宝贵信息，进一步阐明活性氧种类、水平与生物生理、病理的相互关系，乃至疾病的早期诊断具有十分重要的意义。目前，用于细胞水平上活性氧分析的商品化仪器，主要有激光扫描共聚焦显微镜、 扫描隧道显微镜和流式细胞仪。激光扫描共聚焦显微镜和扫描隧道显微镜的优点是可以对细胞内活性氧进行原位、实时动态和空间上的观察与分析；其不足是受其质量测限高、分辨力低等因素限制，难以定量检测单细胞内活性氧的含量。流式细胞仪作为半个世纪以来科学研究和工程技术不断进步的结晶，被广泛应用于生物、医学等领域。例如美国 Bekman-Coulter公司的Cytomics FC500流式细胞仪，其优点是可以对直线流动的细胞进行快速分选和单细胞内多参数的测量。其不足是由于其测量数据是与生物样本比较的相对值，抗体非特异性结合直接影响细胞阳性、阴性的界定，因此需要在使用前对系统进行方法校准或标定，存在操作繁琐、细胞耗量大、仪器体积庞大、价格昂贵等问题。近年来，以微流控芯片为核心的微流控分析在核酸、蛋白质、小分子等方面的应用研究发展迅猛，并正在向单细胞、单分子等领域渗透。与传统的宏观研究体系相比，微流控芯片作为单细胞研究平台具有以下优势1)芯片通道尺寸(通常10-100 μ m)与典型晡乳类细胞的直径大小(一般为10-40 μ m)相匹配，便于细胞操纵；2)芯片通道的二维或三维网络式封闭结构，便于形成与细胞生理状态相接近的特定空间环境；3)芯片的平板式几何构型，容易对细胞进行观察、检测；4)芯片通道尺寸的减小，降低了细胞试样与试剂的消耗，同时可使分析速度成十倍、百倍地提高，便于实现高通量分析力)将各种细胞操纵单元与电泳分离、检测技术组合，便于实现细胞内、尤其是单个细胞内多种化学组分的分离与定性、定量分析。迄今为止，已开展的微流控芯片细胞研究工作，其绝大部分集中在细胞培养、细胞分选、体外细胞微环境模拟、细胞生命过程鉴定等。少量报道的微流控单细胞组分分析是一种创新性尝试，其单个目标细胞的获得(即单细胞捕获)仍需要借助显微镜等观察装置，存在手工操作、速度慢、检测灵敏度低、装置复杂等问题。微流控单细胞组分分析通常包括单细胞进样(细胞上样、单细胞捕获)、溶膜、电泳分离及胞内组分检测等操作步骤。目前，微流控单细胞组分分析所面临的主要技术问题是1)缺少有效操纵单细胞的手段；2) 缺少自动获知单个目标细胞已被捕获的适配技术；幻检测灵敏度有待进一步提高；4)缺少自动实现整个分析过程的仪器联用技术。对于微流控单细胞活性氧分析来讲，新型荧光探针及其装载方法的发展，为单细胞内活性氧的特异性识别与荧光检测奠定了基础。然而，由于受上述技术瓶颈和芯片上细胞活性氧标记技术的限制，目前还没有出现能够检测单个细胞内活性氧的微流控分析仪器。
技术实现思路
本专利技术的目的旨在克服现有技术的不足，提供了一种微流控单细胞活性氧自动分析仪。利用本专利技术可以实现微流控芯片上细胞荧光标记、细胞上样、单细胞捕获、溶膜、电泳分离和胞内活性氧检测等操作，达到无需借助显微境以及手工操作即可自动实现单细胞内活性氧分析的目的。本专利技术的目的可通过如下技术措施来实现所述的分析仪由系统控制模块、细胞荧光标记模块、细胞/流体电动操纵模块、细胞/流体液压操纵模块、微流控芯片与芯片操作平台、单细胞捕获“识别与触发”模块、荧光检测模块、信号处理与数据采集模块、程序软件组成；所述的系统控制模块的核心是一单片机；所述的细胞荧光标记模块包括细胞荧光标记所需微区温度的控制与监测；所述的细胞 /流体电动操纵模块由六路直流高压组成；所述的细胞/流体液压操纵模块由二路微注射泵组成；所述的荧光检测模块由激发光学模块、荧光收集光学模块、激发光与芯片通道对中成像光学模块组成；所述的程序软件由单片机控制程序和PC机应用程序组成。本专利技术的目的还可通过如下技术措施来实现所述的单片机通过RS-485通讯接口与PC机的串行口相连，组成通讯、运算、控制、显示/记录等功能；细胞荧光标记所需微区温度的控制与监测单片机顺序连接温控电路、微型热敏电阻，组成细胞荧光标记的微区温度控制；微型热敏电阻顺序连接A/D转换与温度补偿电路、单片机，组成细胞荧光标记的微区温度监测；六路直流高压分别通过高压导线、钼丝电极与微流控芯片的贮液池对应连接，实现细胞/流体的电动操纵单片机顺序连接一个八通道12位D/A转换电路、一个八通道放大电路、六个并列的DC-DC高压模块、六个并列的“双刀双掷”高压继电器，组成输出模式为“悬空、高压、接地”的所述六路直流高压；六个并列的DC-DC高压模块与单片机之间连接有电压/电流测量电路，组成所述的六路直流高压的输出电压/电流监测；单片机与六个并列的“双刀双掷”高压继电器之间连接有继电器控制电路，组成所述的六路直流高压输出模式一 “悬空、高压、接地”的转换；二路微注射泵分别通过内径为50-500微米的疏水性聚合材料导管与微流控芯片的贮液池对应连接，实现细胞/流体的液压操纵单片机顺序连接驱动电路、二个并列的步进电机、二个并列的微动推拉装置、二个并列的微型注射器，组成工作模式为“推进/灌注、等待、回拉”的所述二路微注射泵；微流控芯片与芯片操作平台，微流控芯片可为不同材质(如，石英、玻璃、PDMS 等)、不同结构(如，贮液池< 8个)的微流控芯片微流控芯片的样品池底部沉积有适合细胞荧光标记的微型热敏电阻，微流控芯片分离通道的入口处沉积有适合单细胞捕获“识别与触发”的二对微电极(A1-A2，B1-B2)；微流控芯片水平固定于芯片操作平台上，芯片操作平台可以X、Y、Z轴三维调节， 且能实现微流控芯片与聚焦物镜焦平面相对位置的任意匹配关系；单细胞捕获“识别与触发”模块单片机与恒流源的输入端相连，恒流源的输出端与微流控芯片分离通道入口处的二对微电极(A1-A2、B1-B2)串联连接；电压测量电路1、电压测量电路2的输入端分别与所述的二对微电极(A1-A2、 B1-B2)并联连接，测量电路1、2的输出端通过甄别电路与单片机相连，组本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种微流控单细胞活性氧自动分析仪，其特征在于：所述的分析仪由系统控制模块（Ｉ）、细胞荧光标记模块（ＩＩ）、细胞／流体电动操纵模块（ＩＩＩ）、细胞／流体液压操纵模块（ＩＶ）、微流控芯片与芯片操作平台（Ｖ）、单细胞捕获“识别与触发”模块（ＶＩ）、荧光检测模块（ＶＩＩ）、信号处理与数据采集模块（ＶＩＩＩ）、程序软件（ＩＸ）组成；所述的系统控制模块（Ｉ）的核心是一单片机（３）；所述的细胞荧光标记模块（ＩＩ）包括细胞荧光标记所需微区温度的控制与监测；所述的细胞／流体电动操纵模块（ＩＩＩ）由六路直流高压组成；所述的细胞／流体液压操纵模块（ＩＶ）由二路微注射泵组成；所述的荧光检测模块（ＶＩＩ）由激发光学模块、荧光收集光学模块、激发光与芯片通道对中成像光学模块组成；所述的程序软件（ＩＸ）由单片机控制程序和ＰＣ机应用程序组成。

【技术特征摘要】
1.一种微流控单细胞活性氧自动分析仪，其特征在于所述的分析仪由系统控制模块 (I)、细胞荧光标记模块(II)、细胞/流体电动操纵模块(III)、细胞/流体液压操纵模块 (IV)、微流控芯片与芯片操作平台(V)、单细胞捕获“识别与触发”模块(VI)、荧光检测模块 (VII)、信号处理与数据采集模块(VIII)、程序软件(IX)组成；所述的系统控制模块(I)的核心是一单片机(3)；所述的细胞荧光标记模块(II)包括细胞荧光标记所需微区温度的控制与监测；所述的细胞/流体电动操纵模块(III)由六路直流高压组成；所述的细胞/流体液压操纵模块(IV)由二路微注射泵组成；所述的荧光检测模块(VII)由激发光学模块、荧光收集光学模块、激发光与芯片通道对中成像光学模块组成；所述的程序软件(IX)由单片机控制程序和PC机应用程序组成。2.根据权利要求1所述的一种微流控单细胞活性氧自动分析仪，其特征在于 所述的单片机(3)通过RS-485通讯接口(2)与PC机(1)的串行口相连，组成通讯、运算、控制、显示/记录功能；所述的细胞荧光标记所需微区温度的控制与监测单片机( 顺序连接温控电路G)、微型热敏电阻(5)，组成细胞荧光标记的微区温度控制；微型热敏电阻( 顺序连接A/D转换与温度补偿电路(6)、单片机(3)，组成细胞荧光标记的微区温度监测； 所述的六路直流高压单片机C3)顺序连接一个八通道12位D/A转换电路(7)、一个八通道放大电路(8)、六个并列的DC-DC高压模块(9)、六个并列的“双刀双掷”高压继电器(10)，组成输出模式为 “悬空、高压、接地”的所述六路直流高压；六个并列的DC-DC高压模块(9)与单片机(3)之间连接有电压/电流测量电路(11)， 组成所述的六路直流高压的输出电压/电流监测；单片机(3)与六个并列的“双刀双掷”高压继电器(10)之间连接有继电器控制电路 (12)，组成所述的六路直流高压输出模式一 “悬空、高压、接地”的转换； 所述的二路微注射泵单片机(3)顺序连接驱动电路(13)、二个并列的步进电机(14)、二个并列的微动推拉装置(15)、二个并列的微型注射器(16)，组成工作模式为“推进/灌注、等待、回拉”的所述二路微注射泵；所述的微流控芯片与芯片操作平台(V)微流控芯片(17)的样品池底部沉积有适合细胞荧光标记的微型热敏电阻(5)，微流控芯片分离通道的入口处沉积有适合单细胞捕获“识别与触发”的二对微电极(A1-A2， B1-B2)；微流控芯片(17)水平固定于芯片操作平台(18)上，芯片操作平台(18)可以X、Y、Z轴三维调节，且能实现微流控芯片(17)与聚焦物镜(201)焦平面相对位置的任意匹配关系； 所述的单细胞捕获“识别与触发”模块(VI)单片机⑶与恒流源(19)的输入端相连，恒流源(19)的输出端与微流控芯片(17)分离通道入口处的二对微电极(Α1-Α2、Β1-Β》串联连接；电压测量电路1(21)、电压测量电路2 (22)的输入端分别与所述的二对微电极(Α1-Α2、B1-B2)并联连接，测量电路1 、2 02)的输出端通过甄别电路OO)与单片机(3)相连， 组成被捕获单细胞到达分离通道入口时的识别，并同时触发单细胞分析中“单细胞捕获、溶膜...

【专利技术属性】
技术研发人员：李清岭，唐波，陈蓁蓁，张欣媛，
申请(专利权)人：山东师范大学，
类型：发明
国别省市：88